【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于检测核酸表观遗传修饰的系统、方法和化合物。
技术介绍
1、产生功能性生物系统的信息写在沿核酸长度方向的碱基序列中。关于dna结构的沃森-克里克双螺旋观点没有考虑到生物体内核酸聚合物的表观遗传修饰。5-甲基胞嘧啶(5mc)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)、5-甲酰基胞嘧啶(5fc)、5-羧基胞嘧啶(5cac)和n6-甲基腺嘌呤(6ma)等一些修饰具有生物学作用。在这些修饰中，5-甲基胞嘧啶(5mc)在人类基因组中含量丰富，并且通常被称为第5碱基。与典型碱基不同，它不能通过细胞复制机制复制，并且因此不能以正常方式遗传。
2、在哺乳动物中，甲基化在5'-cpg-3'的范围内最为普遍。在双螺旋中，互补cpg二分体序列中的两个c通常都被甲基化，但也存在半甲基化状态，其中只有一个c被甲基化，并且被认为是甲基化与去甲基化之间的过渡状态。cpg位点(cpg岛)通常位于基因编码区的上游，并且参与基因活性和组织特异性转录的调节。
3、与确定人类基因组测序相比，绘制人类甲基组图谱是一项更为复杂的任务。由于样品制备需求以及测序前扩增或修饰核酸的要求，从给定样品中全面、高分辨率地确定全基因组甲基化模式一直具有挑战性。
4、目前有多种方法可分离或检测基因组的甲基化部分。最广泛使用的方法涉及用亚硫酸氢盐处理dna，亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶而非5-甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。接着对dna进行扩增(将所有尿嘧啶转化为胸腺嘧啶)，并随后使用各种方法(包括基于微阵列的技术和第2代(例如illumina)测序)进行分析
5、除了功能修饰之外，由于多种试剂对dna的损伤所致的修饰也导致基因突变。就rna而言，虽然人们早已知道trna具有多种修饰，但现在人们越来越认识到，rna通常也具有与其相关的修饰。此外，核酸可通过配体(从金属到dna结合蛋白)的结合进行非共价修饰。
6、鉴于上述背景，本领域需要的是用于检测核酸的表观遗传修饰的改进的系统、方法和化合物。
技术实现思路
1、本公开通过提供用于检测核酸的表观遗传修饰的系统、方法和化合物来解决上文公开的缺点。
2、因此，本公开的一方面涉及提供用于直接确定核酸分子上表观遗传修饰的存在，即检测dna或rna上的甲基化、羟甲基化和其它修饰的方法。
3、在本专利技术的某些方面，提供了用于检测核酸分子中的修饰的方法。一般而言，提供含有具有可能的修饰的核酸序列和至少一种能够结合所述核酸序列的探针的样品。在一些实施方案中，核酸被探针重复结合，并对结合动力学进行监测。
4、在一些实施方案中，核酸分子中的修饰的检测通过直接检测单个分子上的修饰来进行。在一些实施方案中，检测是通过在单个分子上检测到的修饰的独特特征来进行。在一些实施方案中，签名是一种或多种寡核苷酸(oligos)针对其靶分子上的相应互补序列的结合概况。在一些实施方案中，结合概况包括与靶序列杂交的程度(例如量、速度、持续时间)。在一些实施方案中，目标分子固着在平坦表面上。在一些实施方案中，寡核苷酸结合是瞬时且可重复的。瞬时结合可实现超分辨率成像(1)，而重复结合可确保观察到真实信号。此处，结合概况和杂交程度包括每个单独分子上的结合事件的数量(重复结合数量)、这些结合事件的‘开启’或‘停留’时间和“关闭”时间(结合事件之间的时间)。在一些实施方案中，寡核苷酸是短的，长度为7个碱基或更少，典型地为3-5个碱基。在一些实施方案中，寡核苷酸被光学标记(例如，通过荧光染料或纳米粒子或光散射颗粒)并且停留时间是‘亮’时间，而关闭时间是‘暗’时间。
5、本公开发现的令人惊讶的特征(其形成本专利技术的重要实施方案的基础)是当杂交在寡核苷酸瞬时结合的条件下进行时，亮时间、暗时间和/或重复结合数量可用于将结合位点分类为未修饰的或修饰的，并且不同的修饰属于不同的类别。例如，在一些实施方案中，与不具有甲基化位点时相比，当靶序列具有甲基化位点时，寡核苷酸结合的停留时间更长。在一些实施方案中，考虑与碱基周围的序列互补的多个寡核苷酸的结合概况(例如，单个碱基将具有五个5-聚体，所述5-聚体在其结合的碱基足迹中包括所述碱基)以确定所述碱基是否被修饰。多个寡核苷酸靶向同一碱基也增加了冗余，从而增加了测量的稳健性。
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1.一种确定核酸分子的身份和修饰状态的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包括标记的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标记包含一种或多种荧光团、纳米粒子、蛋白质或纳米结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸的长度为<＝8、<＝7、<＝6、<＝5、<＝4或<＝3个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡聚苷酸包含一种或多种修饰，包括LNA残基、3'-Uaq或芘。
6.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种寡核苷酸的所述结合是瞬时的，并且每个靶分子上的每个位点能够瞬时结合多次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述核酸的结合差异作为开启时间和关闭时间和/或信号的荧光强度的函数来测量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中对结合的监测在过程中实时进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中与修饰的和未修饰的核酸序列的结合之间的差异是二元的，使得如果碱基被修饰，则
10.根据权利要求1所述的方法，其中在单个循环中添加多于一种寡核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在多个循环中添加所述多于一种寡核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中相同的寡核苷酸能够确定身份并确定修饰状态。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1c中的寡核苷酸的类型/混合是基于所述修饰的序列环境来选择。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括DNA。
15.根据权利要求1所述的方法，其中多个核酸固着在基底上的可光学分辨的反应位点处，其中所述反应位点之一处的单个核酸能够与固着在任何其它位点处的任何其它核酸分子进行光学分辨。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括RNA。
17.根据权利要求1所述的方法，其中核酸的所述身份包括其基因组起源。
18.根据权利要求1所述的方法，其中对身份的所述确定通过与数据库进行比较来完成，包括将所获得的结合模式与基因组区段的计算机模拟结合模式相匹配。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法利用核酸分子阵列进行。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述阵列中的所述核酸能够在超出光的衍射极限的情况下分辨。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸通过超分辨率成像来分辨。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰是化学修饰，包括5-甲基胞嘧啶(5mC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)、5-羧基胞嘧啶(5caC)和N6-甲基腺嘌呤(6mA)或生物有机体中发现的核酸中常见的任何其它修饰。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰归因于DNA损伤。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰是配体的结合，所述配体包括蛋白质、核酸、小分子、金属。
25.根据权利要求1所述的方法，其中使用掺入对照作为参考。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述重复结合的特征不同，但取平均值以确定所述特征是否将修饰的或未修饰的状态分配给所述核酸。
27.根据权利要求1所述的方法，其中在所述寡核苷酸结合之前对所述核酸进行处理以改变所述修饰。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰状态是针对整个分子或针对部分分子。
29.根据权利要求1所述的方法，其中靶标是细长的并且沿其长度的修饰位置被定位。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子以高密度排列并且使用超分辨率来分辨单独的分子。
31.根据权利要求1所述的方法，其中对所述分子上的修饰的数量进行计数或估计。
32.根据权利要求1所述的方法，其中使用能够区分不同种类的修饰的寡核苷酸。
33.根据权利要求1所述的方法，其中在不同条件下测试不同类型的修饰。
34.一种组合物，所述组合物包含设计用于检测核酸修饰的短荧光标记寡核苷酸探针的混合物。
35.一种确定核酸分子的修饰状态的方法，所述方法包括：
36.一种确定核酸的修饰状态的方法，所述方法包括：
37.一种确定核酸分子的身份和修饰状态的方法，所述方法包括：
38.根据权利要求37所述的方法，其中结合蛋白是抗体或甲基结合蛋...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种确定核酸分子的身份和修饰状态的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包括标记的寡核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述标记包含一种或多种荧光团、纳米粒子、蛋白质或纳米结构。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种寡核苷酸的长度为<＝8、<＝7、<＝6、<＝5、<＝4或<＝3个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡聚苷酸包含一种或多种修饰，包括lna残基、3'-uaq或芘。
6.根据权利要求1所述的方法，其中一种或多种寡核苷酸的所述结合是瞬时的，并且每个靶分子上的每个位点能够瞬时结合多次。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述核酸的结合差异作为开启时间和关闭时间和/或信号的荧光强度的函数来测量。
8.根据权利要求1所述的方法，其中对结合的监测在过程中实时进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中与修饰的和未修饰的核酸序列的结合之间的差异是二元的，使得如果碱基被修饰，则发生高于可检测结合的阈值的结合，并且如果碱基未被修饰，则不会发生可检测的结合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在单个循环中添加多于一种寡核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在多个循环中添加所述多于一种寡核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中相同的寡核苷酸能够确定身份并确定修饰状态。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1c中的寡核苷酸的类型/混合是基于所述修饰的序列环境来选择。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括dna。
15.根据权利要求1所述的方法，其中多个核酸固着在基底上的可光学分辨的反应位点处，其中所述反应位点之一处的单个核酸能够与固着在任何其它位点处的任何其它核酸分子进行光学分辨。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸包括rna。
17.根据权利要求1所述的方法，其中核酸的所述身份包括其基因组起源。
18.根据权利要求1所述的方法，其中对身份的所述确定通过与数据库进行比较来完成，包括将所获得的结合模式与基因组区段的计算机模拟结合模式相匹配。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法利用核酸分子阵列进行。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述阵列中的所述核酸能够在超出光的衍射极限的情况下分辨。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸通过超分辨率成像来分辨。
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