【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新兴的核酸测序技术相关申请的交叉引用本申请要求2017年11月29日提交的标题为“SequencingbyEmergence”的美国专利申请第62/591,850号的优先权，所述专利申请据此通过引用并入。
本公开总体上涉及通过探针与一种或多种多核苷酸的瞬时结合对核酸进行测序的系统和方法。
技术介绍
DNA测序首先通过基于凝胶电泳的方法：双脱氧链终止法(例如，Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.74:5463-5467,1977)以及化学降解方法(例如，Maxam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.74:560-564,1977)成为现实。这些核苷酸测序方法既耗时又昂贵。然而，前者导致了人类基因组的首次测序，尽管花费了十多年和数亿美元。随着个性化医疗保健的梦想越来越接近实现，人们越来越需要廉价的大规模方法来对个体人类基因组进行测序(Mir,SequencingGenomes:FromIndividualstoPopulations,BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics,8:367-378,2009)。几种避免凝胶电泳(并且随后价格更低)的测序方法已被发展为“下一代测序”。一种使用可逆终止子(如由IlluminaInc.实施的)的这样的测序方法占主导地位。Sanger测序的最先进形式和目前占主导地位的Illumina技术中使用的检测方法涉及荧光。检测单核苷酸插入的其它可能手段包括使用质子释放(例如，通过场效应晶体管、通过纳...
【技术保护点】
1.一种核酸测序的方法，所述方法包括：/n(a)将所述核酸以双链线性化拉伸形式固定在测试基板上，从而形成固定的拉伸双链核酸；/n(b)使所述固定的拉伸双链核酸在所述测试基板上变性为单链形式，从而获得所述核酸的固定的第一链和固定的第二链，其中所述固定的第二链的相应碱基与所述固定的第一链的相应互补碱基相邻；/n(c)将所述固定的第一链和所述固定的第二链暴露于寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针的相应库中，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针具有预定的序列和长度，所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述相应的寡核苷酸探针互补的部分结合并形成相应的异源双链体的条件下发生，从而产生相应的光学活性实例；/n(d)使用二维成像器测量在所述暴露(c)期间发生的每个相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间；/n(e)对所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针重复所述暴露(c)和测量(d)，从而获得所述测试基板上的多组位置，所述测试基板上的每个相应组的位置对应于所述寡核苷酸探针组中的寡核苷酸探针；以及/n(f)通过汇编由所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171129 US 62/591,8501.一种核酸测序的方法，所述方法包括：
(a)将所述核酸以双链线性化拉伸形式固定在测试基板上，从而形成固定的拉伸双链核酸；
(b)使所述固定的拉伸双链核酸在所述测试基板上变性为单链形式，从而获得所述核酸的固定的第一链和固定的第二链，其中所述固定的第二链的相应碱基与所述固定的第一链的相应互补碱基相邻；
(c)将所述固定的第一链和所述固定的第二链暴露于寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针的相应库中，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针具有预定的序列和长度，所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述相应的寡核苷酸探针互补的部分结合并形成相应的异源双链体的条件下发生，从而产生相应的光学活性实例；
(d)使用二维成像器测量在所述暴露(c)期间发生的每个相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间；
(e)对所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针重复所述暴露(c)和测量(d)，从而获得所述测试基板上的多组位置，所述测试基板上的每个相应组的位置对应于所述寡核苷酸探针组中的寡核苷酸探针；以及
(f)通过汇编由所述多组位置代表的所述测试基板上的位置，确定来自所述测试基板上的所述多组位置的所述核酸的至少一部分的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述单个探针互补的部分瞬时且可逆地结合并形成所述相应的异源双链体的条件下发生，从而产生光学活性实例。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述单个探针互补的部分重复地瞬时且可逆地结合并形成所述相应的异源双链体的条件下发生，从而重复产生所述相应的光学活性实例。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与标记物结合。
5.如权利要求1所述的方法，其中
所述暴露是在呈染料形式的第一标记物存在的情况下进行的，
所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与第二标记物结合，以及
当所述第一标记物和所述第二标记物彼此非常接近时，所述第一标记物使所述第二标记物发出荧光。
6.如权利要求1所述的方法，其中
所述暴露是在嵌入染料存在的情况下进行的，以及
所述相应的光学活性实例来自嵌入所述寡核苷酸与所述固定的第一链或所述固定的第二链之间的所述相应的异源双链体的所述嵌入染料的荧光，其中所述相应的光学活性实例大于所述嵌入染料在其嵌入所述相应的异源双链体之前的荧光。
7.如权利要求1所述的方法，其中
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中多于一个寡核苷酸探针暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链。
8.如权利要求7所述的方法，其中
在所述暴露(c)的单个实例期间暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链的所述寡核苷酸探针组中的不同寡核苷酸探针与不同的标记物缔合。
9.如权利要求1所述的方法，其中在第一温度下对所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针进行所述暴露(c)，并且所述重复(e)所述暴露(c)和测量(d)包括在第二温度下对所述第一寡核苷酸进行所述暴露(c)和所述测量(d)。
10.如权利要求1所述的方法，其中
在第一温度下对所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针进行所述暴露(c)，
所述重复(e)所述暴露(c)和测量(d)的实例包括在多个不同温度中的每个温度下对所述第一寡核苷酸进行所述暴露(c)和所述测量(d)，以及
所述方法还包括使用通过针对所述第一温度和所述多个不同温度中的每个温度的所述测量(d)而记录的光学活性的测量的位置和持续时间，来构建所述第一寡核苷酸探针的解链曲线。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组包含多个所述寡核苷酸探针亚组，并且其中对所述多个寡核苷酸探针亚组中的每个相应的寡核苷酸探针亚组进行所述暴露(c)和测量(d)的所述重复(e)。
12.如权利要求1所述的方法，其中
所述测量所述测试基板上的位置包括用拟合函数鉴定和拟合所述相应的光学活性实例，以鉴定和拟合通过所述二维成像器获得的数据帧中的所述相应的光学活性实例的中心，以及
所述相应的光学活性实例的中心被认为是所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置。
13.如权利要求1所述的方法，其中
所述相应的光学活性实例在通过所述二维成像器测量的多个帧上持续，
所述测量所述测试基板上的位置包括在所述多个帧上用拟合函数鉴定和拟合所述相应的光学活性实例，以在所述多个帧上鉴定所述相应的光学活性实例的中心，以及
所述相应的光学活性实例的中心被认为是所述多个帧上的所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置。
14.如权利要求1所述的方法，其中
所述测量所述测试基板上的位置包括将通过所述二维成像器测量的数据帧输入到经训练的卷积神经网络中，
所述数据帧包括多个光学活性实例中的所述相应的光学活性实例，
所述多个光学活性实例中的每个光学活性实例对应于与所述固定的第一链或所述固定的第二链的一部分结合的单个探针，以及
响应于所述输入，所述经训练的卷积神经网络鉴定所述多个光学活性实例中的一个或多个光学活性实例中的每一个在所述测试基板上的位置。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述测量以至少20nm的定位精度将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述测量(d)所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间测量所述位置处超过5000个光子。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述相应的光学活性实例比对于所述测试基板观察到的背景高出预定数量的标准偏差。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述预定数量的标准偏差大于3个标准偏差。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个相应的寡核苷酸探针包含独特的N聚体序列，其中N为集合{1，2，3，4，5，6，7，8，9和10}中的整数，并且其中所有长度为N的独特N聚体序列由所述多个寡核苷酸探针表示。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述独特的N聚体序列包含被一个或多个简并核苷酸位置占据的一个或多个核苷酸位置。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少140个碱基，并且所述确定(f)确定所述核酸序列的序列覆盖度大于70％。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中核酸的长度为至少10,000个碱基。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为约1,000,000个碱基长度的泊松分布。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中在重复所述暴露(c)和测量(d)之前，洗涤所述测试基板，从而在将所述测试基板暴露于所述寡核苷酸探针组中的另一个寡核苷酸探针之前，从所述测试基板移除相应的寡核苷酸探针。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述固定(a)包括通过分子梳理(后退弯月面)、流动拉伸纳米约束或电拉伸将所述核酸施加到所述测试基板。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中每个相应的光学活性实例具有满足预定阈值的观察度量。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述观察度量包括持续时间、信噪比、光子计数、像素足迹或强度。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述预定阈值区分
(i)第一结合形式，其中所述独特的N聚体序列的每个残基与所述核酸的所述固定的第一链或所述固定的第二链中的互补碱基结合，和
(ii)第二结合形式，其中在所述独特的N聚体序列与所述核酸的所述固定的第一链或所述固定的第二链中的序列之间存在至少一个错配，所述相应的寡核苷酸探针已与所述核酸的所述固定的第一链或所述固定的第二链中的序列结合以形成所述相应的光学活性实例。
29.如权利要求26或28所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的每个相应的寡核苷酸探针都具有其自己相应的预定阈值。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的每个相应的寡核苷酸探针的所述预定阈值源自训练数据集。
31.如权利要求30所述的方法，其中
所述寡核苷酸探针组中的每个相应的寡核苷酸探针的所述预定阈值源自所述训练数据集，以及
对于所述寡核苷酸探针组中的每个相应的寡核苷酸探针，所述训练集包括对在与参考序列结合时所述相应的寡核苷酸探针的观察度量的测量值，所述与参考序列的结合使得所述相应的寡核苷酸探针的所述独特的N聚体序列的每个残基与所述参考序列中的互补碱基结合。
32.如权利要求31所述的方法，其中将所述参考序列包含在所述核酸中并固定在所述测试基板上。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针：
通过与所述固定的第一链的互补部分结合产生第一光学活性实例，以及
通过与所述固定的第二链的互补部分结合产生第二光学活性实例。
34.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针：
通过与所述固定的第一链的两个或更多个互补部分结合产生两个或更多个第一光学活性实例，以及
通过与所述固定的第二链的两个或更多个互补部分结合产生两个或更多个第二光学活性实例。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述相应的寡核苷酸探针在所述暴露(c)期间与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述相应的寡核苷酸探针互补的部分结合3次或更多次，从而产生3个或更多个光学活性实例，每个光学活性实例代表所述多个结合事件中的一个结合事件。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述暴露(c)发生在所述二维成像器的1个或多个帧上。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述暴露(c)发生在所述二维成像器的2个或更多个帧上。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都具有相同的长度。
39.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中
所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都具有相同的长度M，
M为2或更大的正整数，以及
所述确定(f)来自所述测试基板上的所述多组位置的所述核酸的至少一部分的序列还使用由所述多组位置代表的所述寡核苷酸探针的重叠序列。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述确定来自所述测试基板上的所述多组位置的所述核酸的至少一部分的序列包括确定对应于所述固定的第一链的第一覆瓦式途径和对应于所述固定的第二链的第二覆瓦式途径。
41.如权利要求40所述的方法，其中使用所述第二覆瓦式途径的相应部分来解决所述第一覆瓦式途径中的中断。
42.如权利要求40所述的方法，其中使用从所述核酸的另一实例获得的第三覆瓦式途径或第四覆瓦式途径的相应部分来解决所述第一覆瓦式途径或所述第二覆瓦式途径中的中断。
43.如权利要求40所述的方法，其中使用所述第一覆瓦式途径和所述第二覆瓦式途径的相应部分来增加所述序列的序列分配的可信度。
44.如权利要求40所述的方法，其中使用从所述核酸的另一实例获得的第三覆瓦式途径或第四覆瓦式途径的相应部分来增加所述序列的序列分配的可信度。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述测试基板是二维表面。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中在所述固定(a)之前，用包含7-辛烯基三氯硅烷的乙烯基硅烷涂层涂覆所述测试基板。
47.一种核酸测序的方法，所述方法包括：
(a)将所述核酸以线性化拉伸形式固定在测试基板上，从而形成固定的拉伸核酸；
(b)将所述固定的拉伸核酸暴露于寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针的相应库，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针具有预定的序列和长度，所述暴露(b)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的核酸的与所述相应的寡核苷酸探针互补的部分瞬时且可逆地结合的条件下发生，从而产生相应的光学活性实例；
(c)使用二维成像器测量在所述暴露(b)期间发生的每个相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间；
(d)对所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针重复所述暴露(b)和测量(c)，从而获得所述测试基板上的多组位置，所述测试基板上的每个相应组的位置对应于所述寡核苷酸探针组中的寡核苷酸探针；以及
(e)通过汇编由所述多组位置代表的所述测试基板上的位置，确定来自所述测试基板上的所述多组位置的所述核酸的至少一部分的序列。
48.一种分析核酸的方法，所述方法包括：
(a)将所述核酸以双链形式固定在测试基板上，从而形成固定的双链核酸；
(b)使所述固定的双链核酸在所述测试基板上变性为单链形式，从而获得所述核酸的固定的第一链和固定的第二链，其中所述固定的第二链与所述固定的第一链互补；以及
(c)暴露所述固定的第一链以及
49.一种核酸测序的方法，所述方法包括：
(a)将所述核酸以双链线性化拉伸形式固定在测试基板上，从而形成固定的拉伸双链核酸；
(b)使所述固定的拉伸双链核酸在所述测试基板上变性为单链形式，从而获得所述核酸的固定的第一链和固定的第二链，其中所述固定的第二链的相应碱基与所述固定的第一链的相应互补碱基相邻；
(c)将所述固定的第一链和所述固定的第二链暴露于寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针的相应库中，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针具有预定的序列和长度，所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述相应的寡核苷酸探针互补的部分结合并形成相应的异源双链体的条件下发生，从而产生相应的光学活性实例；
(d)使用二维成像器测量在所述暴露(c)期间发生的每个相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间；
(e)对所述寡核苷酸探针组中的相应的寡核苷酸探针重复所述暴露(c)和测量(d)，从而获得所述测试基板上的多组位置，所述测试基板上的每个相应组的位置对应于所述寡核苷酸探针组中的寡核苷酸探针；以及
(f)通过汇编由所述多组位置代表的所述测试基板上的位置，确定来自所述测试基板上的所述多组位置的所述核酸的至少一部分的序列。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述单个探针互补的部分瞬时且可逆地结合并形成所述相应的异源双链体的条件下发生，从而产生光学活性实例。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述暴露(c)在允许所述相应的寡核苷酸探针的相应库中的单个探针与所述固定的第一链或所述固定的第二链的与所述单个探针互补的部分重复地瞬时且可逆地结合并形成所述相应的异源双链体的条件下发生，从而重复产生所述相应的光学活性实例。
52.如权利要求49所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与标记物结合。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述标记物是染料、荧光纳米颗粒或光散射颗粒。
54.如权利要求49所述的方法，其中
所述暴露是在呈嵌入染料形式的第一标记物存在的情况下进行的，
所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与第二标记物结合，
所述第一标记物和第二标记物具有重叠的供体发射和受体激发光谱，当所述第一标记物和第二标记物彼此非常接近时，使得所述第一标记物和所述第二标记物之一发出荧光，以及
所述相应的光学活性实例来自所述嵌入染料与所述第二标记物的接近，所述嵌入染料嵌入所述寡核苷酸与所述固定的第一链或所述固定的第二链之间的所述相应的异源双链体中。
55.如权利要求49所述的方法，其中
所述暴露是在呈嵌入染料形式的第一标记物存在的情况下进行的，
所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与第二标记物结合，
当所述第一标记物和所述第二标记物彼此非常接近时，所述第一标记物使所述第二标记物发出荧光，以及
所述相应的光学活性实例来自所述嵌入染料与所述第二标记物的接近，所述嵌入染料嵌入所述寡核苷酸与所述固定的第一链或所述固定的第二链之间的所述相应的异源双链体中。
56.如权利要求49所述的方法，其中
所述暴露是在呈嵌入染料形式的第一标记物存在的情况下进行的，
所述寡核苷酸探针组中的每个寡核苷酸探针都与第二标记物结合，
当所述第一标记物和所述第二标记物彼此非常接近时，所述第二标记物使所述第一标记物发出荧光，以及
所述相应的光学活性实例来自所述嵌入染料与所述第二标记物的接近，所述嵌入染料嵌入所述寡核苷酸与所述固定的第一链或所述固定的第二链之间的所述相应的异源双链体中。
57.如权利要求49所述的方法，其中
所述暴露是在嵌入染料存在的情况下进行的，以及
所述相应的光学活性实例来自嵌入所述寡核苷酸与所述固定的第一链或所述固定的第二链之间的所述相应的异源双链体中的所述嵌入染料的荧光，其中所述相应的光学活性实例大于嵌入染料在其嵌入所述相应的异源双链体之前的荧光。
58.如权利要求49所述的方法，其中
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的多于一个寡核苷酸探针暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，以及
在所述暴露(c)的所述单个实例期间暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链的所述寡核苷酸探针组中的每个不同的寡核苷酸探针与不同的标记物缔合。
59.如权利要求58所述的方法，其中
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针的第一库暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，所述第一寡核苷酸探针与第一标记物缔合，
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的第二寡核苷酸探针的第二库暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，所述第二寡核苷酸探针与第二标记物缔合，以及
所述第一标记物与所述第二标记物是不同的。
60.如权利要求58所述的方法，其中
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针的第一库暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，所述第一寡核苷酸探针与第一标记物缔合，
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的第二寡核苷酸探针的第二库暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，所述第二寡核苷酸探针与第二标记物缔合，
在所述暴露(c)的单个实例期间所述寡核苷酸探针组中的第三寡核苷酸探针的第三库暴露于所述固定的第一链和所述固定的第二链，所述第三寡核苷酸探针与第三标记物缔合，以及
所述第一标记物、所述第二标记物和所述第三标记物各自不同。
61.如权利要求49所述的方法，其中对所述寡核苷酸探针组中的每个单个寡核苷酸探针进行所述重复(e)、所述暴露(c)和所述测量(d)。
62.如权利要求49所述的方法，其中在第一温度下对所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针进行所述暴露(c)，并且所述重复(e)、所述暴露(c)和所述测量(d)包括在第二温度下对所述第一寡核苷酸进行所述暴露(c)和所述测量(d)。
63.如权利要求49所述的方法，其中
在第一温度下对所述寡核苷酸探针组中的第一寡核苷酸探针进行所述暴露(c)，
所述重复(e)、所述暴露(c)和所述测量(d)的实例包括在多个不同温度中的每个温度下对所述第一寡核苷酸进行所述暴露(c)和所述测量(d)，以及
所述方法还包括使用通过针对所述第一温度和所述多个不同温度中的每个温度的所述测量(d)而记录的光学活性的测量的位置和持续时间，来构建所述第一寡核苷酸探针的解链曲线。
64.如权利要求49所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组包含多个所述寡核苷酸探针亚组，并且其中对所述多个寡核苷酸探针亚组中的每个相应的寡核苷酸探针亚组进行所述重复(e)、所述暴露(c)和所述测量(d)。
65.如权利要求64所述的方法，其中每个相应的寡核苷酸探针亚组包含来自所述寡核苷酸探针组的两种或更多种不同的探针。
66.如权利要求64所述的方法，其中每个相应的寡核苷酸探针亚组包含来自所述寡核苷酸探针组的四种或更多种不同的探针。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述寡核苷酸探针组由四个寡核苷酸探针亚组组成。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述方法还包括基于每个寡核苷酸探针的计算的或实验推导的解链温度将所述寡核苷酸探针组划分成所述多个寡核苷酸探针亚组，其中通过所述划分将具有相似解链温度的寡核苷酸探针置于相同的寡核苷酸探针亚组中，并且其中所述暴露(c)的实例的温度或持续时间由所述相应的寡核苷酸探针亚组中的所述寡核苷酸探针的平均解链温度确定。
69.如权利要求64所述的方法，其中
所述方法还包括基于每个寡核苷酸探针的序列将所述寡核苷酸探针组划分成所述多个寡核苷酸探针亚组，其中将具有重叠序列的寡核苷酸探针置于不同的亚组中。
70.如权利要求49所述的方法，其中
所述测量所述测试基板上的位置包括用拟合函数鉴定和拟合所述相应的光学活性实例，以鉴定和拟合通过所述二维成像器获得的数据帧中的所述相应的光学活性实例的中心，以及
所述相应的光学活性实例的中心被认为是所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述拟合函数是高斯函数、第一矩函数、基于梯度的方法或傅立叶变换。
72.如权利要求49所述的方法，其中
所述相应的光学活性实例在通过所述二维成像器测量的多个帧上持续，
所述测量所述测试基板上的位置包括在所述多个帧上用拟合函数鉴定和拟合所述相应的光学活性实例，以在所述多个帧上鉴定所述相应的光学活性实例的中心，以及
所述相应的光学活性实例的中心被认为是所述多个帧上的所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述拟合函数是高斯函数、第一矩函数、基于梯度的方法或傅立叶变换。
74.如权利要求49所述的方法，其中
所述测量所述测试基板上的位置包括将通过所述二维成像器测量的数据帧输入到经训练的卷积神经网络中，
所述数据帧包括多个光学活性实例中的所述相应的光学活性实例，
所述多个光学活性实例中的每个光学活性实例对应于与所述固定的第一链或所述固定的第二链的一部分结合的单个探针，以及
响应于所述输入，所述经训练的卷积神经网络鉴定所述多个光学活性实例中的一个或多个光学活性实例中的每一个在所述测试基板上的位置。
75.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述测量以至少20nm的定位精度将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置。
76.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述测量以至少2nm的定位精度将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置。
77.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述测量以至少60nm的分辨率将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置。
78.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述测量以至少6nm的分辨率将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置。
79.如权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述测量将所述相应的光学活性实例的中心解析为所述测试基板上的位置，其中所述位置是亚衍射极限位置。
80.如权利要求49-78中任一项所述的方法，其中所述测量(d)所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间测量所述位置处超过5000个光子。
81.如权利要求49-78中任一项所述的方法，其中所述测量(d)所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间测量所述位置处超过50,000个光子。
82.如权利要求49-78中任一项所述的方法，其中所述测量(d)所述相应的光学活性实例在所述测试基板上的位置和持续时间测量所述位置处超过200,000个光子。
83.如权利要求49-82中任一项所述的方法，其中所述相应的光学活性实例比对于所述测试基板观察到的背景高出预定数量的标准偏差。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述预定数量的标准偏差是3个标准偏差。
85.如权利要求83所述的方法，其中所述预定数量的标准偏差是6个标准偏差。
86.如权利要求49-85中任一项所述的方法，其中所述多个寡核苷酸探针中的每个相应的寡核苷酸探针包含独特的N聚体序列，其中N是所述集合{1，2，3，4，5，6，7，8和9}中的整数，并且其中所有长度为N的独特N聚体序列由所述多个寡核苷酸探针表示。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述独特的N聚体序列包含被一个或多个简并核苷酸占据的一个或多个核苷酸位置。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述一个或多个核苷酸位置中的每个简并核苷酸位置被通用碱基占据。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述通用碱基是2′-脱氧肌苷。
90.如权利要求86所述的方法，其中所述独特的N-聚体序列的5’侧是单个简并核苷酸位置，并且3’侧是单个简并核苷酸位置。
91.如权利要求90所述的方法，其中5’单个简并核苷酸和所述3’单个简并核苷酸各自为2’-脱氧肌苷。
92.如权利要求49-91中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少140个碱基，并且所述确定(f)确定所述核酸序列的序列覆盖度大于70％。
93.如权利要求49-91中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少140个碱基，并且所述确定(f)确定所述核酸序列的序列覆盖度大于90％。
94.如权利要求49-91中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少140个碱基，并且所述确定(f)确定所述核酸序列的序列覆盖度大于99％。
95.如权利要求49-91中任一项所述的方法，其中所述确定(f)确定所述核酸序列的序列覆盖度大于99％。
96.如权利要求49-95中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少10,000个碱基。
97.如权利要求49-95中任一项所述的方法，其中所述核酸的长度为至少1,000,000个碱基。
98.如权利要求49-97中任一项所述的方法，其中在重复所述暴露(c)和测量(d)之前，洗涤所述测试基板，从而在将所述测试基板暴露于所述寡核苷酸探针组中的另一个寡核苷酸探针之前，从所述测试基板移除相应的寡核苷酸探针。
99.如权利要求49-98中任一项所述的方法，其中所述固定(a)包括通过分子梳理、流动拉伸纳米约束或电拉伸将所述核酸施加到所述测试基板。
100.如权利要求49-98中任一项所述的方法，其中每个相应的光学活性实例具有满足预定阈值的观察度量。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述观察度量包括持续时间、信噪比、光子计数或强度。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述预定阈值区分
(i)第一结合形式，其中所述独特的N聚体序列的每个残基与所述核酸的所述固定...
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