【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脂肪间充质干细胞成骨诱导，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法。
技术介绍
1、干细胞是机体各个组织和器官的最初来源，具有增殖及分化的能力，随着医疗技术的快速发展，其在细胞移植，组织工程以及再生医学方面发挥了重要作用。尤其骨组织工程是组织工程领域中发展最为快速的学科，干细胞则是组织工程的主要种子细胞。脂肪间充质干细胞是干细胞中优势较明显的一种细胞。脂肪组织是最容易获取的间充质干细胞来源。脂肪组织中含有大量未分化的干细胞，且储量丰富。相对于骨髓间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞可以取材于抽脂术或外科手术中弃去的皮下脂肪，取材方便、来源广泛，不涉及社会和道德伦理等方面的争议。脂肪间充质干细胞在不同的条件下可被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞等中胚层细胞，是组织工程的理想种子细胞。
2、但是目前脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法常见的一些问题，比如成骨诱导率低，操作复杂，周期长等，因此我们提出了一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法。
2、本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，所述一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法包括以下步骤：
3、步骤一：首先对脂肪间充质干细胞的分离和萃取；
4、步骤
5、步骤三：接着cck8检测细胞动力学能力；
6、步骤四：随之进行人脂肪间充质干细胞成骨诱导；
7、步骤五：最后进行rt-pcr检测。
8、进一步的，所述步骤一中将脂肪抽吸后液体800r/min×3min离心,留上层漂浮的脂肪组织,pbs漂洗,800r/min×5min离心2次,留上层脂肪；加入2倍体积0.2％胶原酶,37℃摇床消化45min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤,1500r/min×5min离心,沉淀物以1m l dmem重悬,加5m l红细胞裂解液,室温静置10min；1500r/min×5min离心,pbs漂洗,离心,细胞培养基重悬,5×108l-1细胞浓度接种；37℃、体积分数5％co2孵育,静置3d后酌情换液。细胞长至80％融合时0.25％胰酶消化传代。原代细胞培养达到80％-90％融合的时候,细胞计数,1∶2比例消化传代，细胞形态学检测:倒置相差显微镜观察细胞形态,苏木精-伊红染色观察细胞形态。
9、进一步的，所述步骤二中取p1,p2,p3,p6,p10代细胞流式细胞仪检测细胞标记物,正常消化,收集细胞到离心管中,细胞计数,300×g,5min离心,去上清,加入dpbs调整浓度；
10、同时按1010l-1的浓度转移到5ml细胞管中；分别加入20μl的cd49d-pe,cd105-pe,cd44-pe,cd45-fitc,cd31-fitc,cd106-fitc抗体,常温遮光孵育15min,加入dpbs稀释,离心去上清,再分别加入500μldpbs进行重悬,上机检测。
11、进一步的，所述步骤三中取p1,p3,p6,p9代细胞,调整细胞浓度为107l-1,接种细胞到96孔板中,每孔1000个细胞,放入培养箱培养,1,2,3,4,5,6d分别加入cck8孵育4h后,酶标仪检测a值,绘制生长曲线。
12、进一步的，所述步骤四中取p3代细胞,以成骨诱导培养基进行成骨诱导,成骨诱导剂组成:常规培养基中加入10mmol/lβ-磷酸甘油,100μmol/l地塞米松,0.05mmol/l维生素c。成骨诱导7d后进行碱性磷酸酶染色,28d后进行茜素红钙结节染色。
13、进一步的，步骤五中取成骨诱导0,3,7,14,21,28d细胞,加入裂解液提取rna,反转录cdna链,根据实验要求查到目的基因骨桥蛋白、碱性磷酸酶的mrna序列,由上海生工公司根据要求合成pcr引物,rt-pcr检测骨桥蛋白、碱性磷酸酶mrna表达，imgaej软件分析膜上印迹，并以gapdh为内对照计算相对灰度值。
14、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法能有效提高细胞的成骨增殖分化效率，且能有效促进脂肪间充质干细胞的成骨分化，提高成骨分化的效率，缩短细胞分化时间，采用本专利技术提供的组合物可以高效稳定的对脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化，保障了脂肪间充质干细胞在骨组织工程中的应用。
15、上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
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1.一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述步骤一中将脂肪抽吸后液体800r/min×3min离心,留上层漂浮的脂肪组织,PBS漂洗,800r/min×5min离心2次,留上层脂肪；加入2倍体积0.2％胶原酶,37℃摇床消化45min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤,1500r/min×5min离心,沉淀物以1m L DMEM重悬,加5m L红细胞裂解液,室温静置10min；1500r/min×5min离心,PBS漂洗,离心,细胞培养基重悬,5×108L-1细胞浓度接种；37℃、体积分数5％CO2孵育,静置3d后酌情换液。细胞长至80％融合时0.25％胰酶消化传代，原代细胞培养达到80％-90％融合的时候,细胞计数,1∶2比例消化传代，细胞形态学检测:倒置相差显微镜观察细胞形态,苏木精-伊红染色观察细胞形态。
3.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导
4.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述步骤三中取P1,P3,P6,P9代细胞,调整细胞浓度为107L-1,接种细胞到96孔板中,每孔1000个细胞,放入培养箱培养,1,2,3,4,5,6d分别加入CCK8孵育4h后,酶标仪检测A值,绘制生长曲线。
5.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述步骤四中取P3代细胞,以成骨诱导培养基进行成骨诱导,成骨诱导剂组成:常规培养基中加入10mmol/Lβ-磷酸甘油,100μmol/L地塞米松,0.05mmol/L维生素C。成骨诱导7d后进行碱性磷酸酶染色,28d后进行茜素红钙结节染色。
6.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：步骤五中取成骨诱导0,3,7,14,21,28d细胞,加入裂解液提取RNA,反转录cDNA链,根据实验要求查到目的基因骨桥蛋白、碱性磷酸酶的mRNA序列,由上海生工公司根据要求合成PCR引物,RT-PCR检测骨桥蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达，ImgaeJ软件分析膜上印迹，并以GAPDH为内对照计算相对灰度值。
...【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述步骤一中将脂肪抽吸后液体800r/min×3min离心,留上层漂浮的脂肪组织,pbs漂洗,800r/min×5min离心2次,留上层脂肪；加入2倍体积0.2％胶原酶,37℃摇床消化45min；将糊状消化液用100目不锈钢滤网过滤,1500r/min×5min离心,沉淀物以1m l dmem重悬,加5m l红细胞裂解液,室温静置10min；1500r/min×5min离心,pbs漂洗,离心,细胞培养基重悬,5×108l-1细胞浓度接种；37℃、体积分数5％co2孵育,静置3d后酌情换液。细胞长至80％融合时0.25％胰酶消化传代，原代细胞培养达到80％-90％融合的时候,细胞计数,1∶2比例消化传代，细胞形态学检测:倒置相差显微镜观察细胞形态,苏木精-伊红染色观察细胞形态。
3.如权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞成骨诱导组合物及成骨诱导方法，其特征在于：所述步骤二中取p1,p2,p3,p6,p10代细胞流式细胞仪检测细胞标记物,正常消化,收集细胞到离心管中,细...
【专利技术属性】
技术研发人员：方旖，陈巧林，
申请(专利权)人：台州市耶大基因与细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：
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