【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种无抗性标记基因组整合和游离质粒共表达外源基因的枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程。
技术介绍
1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种国际上公认(generally recognizedas safe，gras)的安全微生物，因其蛋白分泌能力强，遗传背景清晰，易于分离培养，无显著密码子偏好性等特性，被广泛应用于工业酶的生产。但在大部分工业酶的生产过程中，基于游离质粒表达的重组菌培养的过程中需要添加抗生素作为筛选压力，对重组菌株进行筛选，同时避免重组质粒在传代中出现大批量的丢失，以此保证目标产物的高效生产和维持重组质粒的稳定性，但抗生素的使用，不仅会增加在工业酶发酵制备时期额外添加抗生素的生产成本，而且抗生素使用后需在产品纯化时将抗生素进一步的分离去除，也为下游分离纯化增加了难度和生产成本，更重要的是抗生素的添加会带来食品安全隐患，不符合食品行业工业用酶要求。因此构建无抗生素筛选标记外源蛋白高效表达重组菌是很有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种食品安全的枯草芽孢杆菌，在出发菌株的基础上进行了如下改进：
2、(1)在srfc、spoiiac、amye、nprb、npre、apre、bpr、mpr、epr中的至少一个位点整合谷氨酸脱羧酶基因；
3、(2)以pubdal为表达载体，表达谷氨酸脱羧酶基因。
4、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是利用cre/lox基因编辑系统整合所述谷氨酸脱羧酶基
5、在一种实施方式中，所述出发菌株为枯草芽孢杆菌ws9c。
6、在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶基因gada的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌ws9c菌株是利用crispr/cas9基因编辑系统在枯草芽孢杆菌ws9上的amye位点整合了comk基因，所述枯草芽孢杆菌ws9菌株是利用crispr/cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌ws的srfc，spoiiac，amye，nprb，npre，apre，bpr，mpr和epr这9个基因，基因经敲除后减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生(上述菌株公开于论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》)。
8、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c1。
9、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre和apre位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c2。
10、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre、apre和nprb位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c3。
11、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre、apre、nprb和srfa位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c4。
12、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre、apre、nprb、srfa和mpr位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c5。
13、在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是在npre、apre、nprb、srfa、mpr和bpr位点整合gada基因，获得重组菌株ws9c6。
14、本专利技术还提供了构建所述枯草芽孢杆菌的方法。
15、在一种实施方式中，枯草芽孢杆菌ws9c6的构建方法为：
16、(1)以枯草芽孢杆菌ws9c基因组为模板，pcr扩增npre位点的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段，两片段各1000bp左右；
17、(2)以质粒phy300plk为模板，pcr扩增筛选标记基因tet，得到lox72-tet-lox66表达框；pcr扩增出外源酶基因表达盒；
18、(3)将步骤(1)得到的同源修复臂上下游片段和通过步骤(2)得到的lox72-tet-lox66表达框和外源酶基因表达框，四部分通过重叠pcr的方式连接起来，获得与抗性基因以及同源臂相连的外源酶基因整合框；
19、(4)将步骤(3)构建的外源酶基因整合框转化至枯草芽孢杆菌ws9c感受态中，通过四环素抗性筛选转化子，并验证转化子，得到整合外源酶基因并带有抗性基因tet的整合菌株；
20、(5)将步骤(4)构建的整合外源酶基因并带有抗性基因tet的整合菌株制备感受态，向其中转入质粒pe194-cre并用iptg诱导cre表达，通过卡那霉素抗性筛选转化子，并验证转化子，获得带有质粒pe194-cre并且抗性基因tet消除的外源酶基因整合菌株；
21、(6)将步骤(5)构建的带有质粒pe194-cre的外源酶基因整合菌株进行热处理，消除质粒pe194-cre，获得在npre位点成功整合外源酶基因枯草芽孢杆菌ws9c1；
22、(7)将步骤(6)所构建的菌株ws9c1作为受体，使用步骤(1)～(6)同样的策略将外源酶基因依次叠加整合至apre、nprb、srfa、mpr和bpr位点，依次得到重组菌株ws9c2、ws9c3、ws9c4、ws9c5、ws9c6。
23、在一种实施方式中，所述质粒phy300plk公开于论文《e.coli谷氨酸脱羧酶在b.subtilis中的异源表达、发酵优化及制备γ-氨基丁酸的研究》。
24、在一种实施方式中，所述外源酶为谷氨酸脱羧酶。
25、在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶通过启动子phpaii-pamyq’起始转录。
26、在一种实施方式中，所述启动子phpaii-pamyq’的核苷酸序列如seq id no.2所示。
27、本专利技术还提供了所述枯草芽孢杆菌ws9c6在表达用于食品生产的蛋白方面的应用。
28、在一种实施方式中，所述应用是用于生产谷氨酸脱羧酶。
29、在一种实施方式中，所述应用是用于生产γ-氨基丁酸或含γ-氨基丁酸的产品。
30、本专利技术还提供了所述枯草芽孢杆菌在食品工业或饲料工业中的应用。
31、有益效果：本专利技术将谷氨酸脱羧酶基因通过基因组整合结合游离质粒共表达，构建了不含有抗性基因筛选标记的重组枯草芽孢杆菌，将其用于谷氨酸脱羧酶的发酵生产，实现了谷氨酸脱羧酶的食品级的高效表达。本专利技术构建的重组枯草芽孢杆菌可在3-l罐发酵68h的谷氨酸脱羧酶酶活达到199.49u·ml-1。对于谷氨酸脱羧酶应用于生产具有多种生理功能的γ-氨基丁酸具有重要意义。
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1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上具有如下改进：
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在srfC、amyE、nprB、nprE、aprE、bpr和mpr位点分别整合谷氨酸脱羧酶基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶基因gadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述出发菌株为枯草芽孢杆菌WS9C。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶通过启动子PHpaII-PamyQ’起始转录。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子PHpaII-PamyQ’的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.构建权利要求1～6任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，利用Cre/lox基因编辑系统在出发菌株的基因组上整合所述谷氨酸脱羧酶基因。
8.一种提高外源酶蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量的方法，
9.权利要求1～6任一所述的重组枯草芽孢杆菌在表达用于食品生产的蛋白方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是用于生产谷氨酸脱羧酶、γ-氨基丁酸或含γ-氨基丁酸的产品。
...【技术特征摘要】
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在出发菌株的基础上具有如下改进：
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在srfc、amye、nprb、npre、apre、bpr和mpr位点分别整合谷氨酸脱羧酶基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶基因gada的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述出发菌株为枯草芽孢杆菌ws9c。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶通过启动子phpaii-pamyq’起始转录。
6.根据权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动...
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