【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，尤其涉及一种基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法。
技术介绍
1、滚环扩增(rolling circle amplification,rca)技术是一种通过酶介导的恒温核酸扩增技术，被广泛应用于生物医学、食品安全检测等领域，具有生物稳定性高、容量高和生物相容性佳等优点。rca反应是以环状dna/rna为聚合模板，通过部分与环状模板互补的短引物链，在dna聚合酶和dntps作用下，常温快速扩增出成百上千组与模板互补的重复序列，以此形成长单链dna，即rca能快速高效扩增核酸分子。
2、荧光偏振(fluorescence polarization,fp)检测技术，是通过分析体系中荧光分子的偏振信号变化差异，实现对分子间相互作用的研究以及所选目标物的检测，具有灵敏度高、分析快速、操作简便和易实现高通量测定等多种优势，被用于生化分析和疾病诊断等领域。
3、赭曲霉毒素是由曲霉属和青霉属等真菌产生的次生代谢产物。赭曲霉毒素结构类似物中赭曲霉毒素a(ochratoxin a,ota)性质稳定且毒性最强，会损害生物肾脏和肝脏部位，严重造成中毒、畸形、癌变，甚至死亡，国际癌症研究机构将ota列为2b类人类致癌物。ota在自然界中分布广泛，常规的产品加工不能有效去除ota。摄入ota污染过的农产品和食物等，会对人体健康造成严重危害。目前我国对ota的检测方法主要是仪器分析。但仪器分析对样品处理、仪器以及操作人员的要求较高且难以实现快速检测。检测ota的免疫学分析技术所需的抗体抗原制备技术复杂，检
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，以解决上述技术问题。
2、本专利技术目的之一在于提供一种基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，包括以下步骤：
3、第一步、采用哑铃型h链制备哑铃型环状模板hh，哑铃型h链的核苷酸序列为seqid no.2：
4、第二步、核酸适配体与引物杂交形成双链适配体/引物，引物的核苷酸序列为seqid no.4-7的任一条；加入0-100ng/ml的赭曲霉毒素a，进行目标物识别，释放引物；
5、第三步、向第二步得到的溶液中加入哑铃型环状模板hh、phi29 dna聚合酶、dntps制备rca产物；
6、第四步、向第三步得到的溶液中加入fam-dna后，制备具有fam荧光信号输出的rca产物；fam-dna的核苷酸序列为5′-fam-aaaaaaaaaaa-3′；
7、第五步、向待测样品中加入0-20ng/ml的赭曲霉毒素a制备标准加标溶液，按照第二步和第三步进行加标回收实验，建立目标物检测的标准曲线，计算荧光偏振差值，计算加标后的回收率。
8、第五步、向待测样品加入0-20ng/ml的赭曲霉毒素a制备标准加标溶液，按照第二步和第三步进行加标回收实验，建立目标物检测的标准曲线，计算荧光偏振差值，得到加标后的回收率。
9、优选的，第三步中，phi29 dna聚合酶的用量为0.05-0.1u。
10、优选的，第一步中，连接成环的反应时间为15-60min。
11、优选的，第一步中，连接成环的反应体系温度≤37℃。
12、优选的，第三步中，hh的实验浓度10-20nm。
13、优选的，第三步中，dntps的浓度为10-20μm。
14、优选的，第三步中，rca反应时间1-3小时。
15、优选的，第三步中，rca产物的孵育温度≤37℃，孵育时间10-30分钟。
16、优选的，第二步中，引物的浓度＜20nm。
17、本专利技术还提供上述荧光偏振分析方法在检测产品中赭曲霉毒素a的应用。优选的，产品为红葡萄酒。
18、本专利技术有益效果在于：
19、1、本专利技术提供的荧光偏振分析方法将滚环扩增信号扩增技术与荧光偏振技术相结合，以环境污染物赭曲霉毒素a(ochratoxin a,ota)为目标分析物，利用具有高亲和力的核酸适配体(ap)对ota进行特异性识别。通过ota竞争结合适配体释放引物，触发rca，从而实现体系的偏振信号放大，实现ota的实际分析测定，整个方法灵敏度佳、特异性高、稳定性好，检测限为0.01pg/ml，当靶标浓度在1×10-5-10ng/ml的范围内，ota浓度与体系荧光偏振差值的对数呈良好的线性关系，整个检测时间约6小时，为ota的快速灵敏检测提供了技术支持，具有重要的应用价值。
20、2、滚环扩增技术在常温下可扩增出成百上千组具有重复序列的长单链dna，可实现引物的指数级扩增以及数百千倍的信号放大。将滚环扩增形成前后产物与荧光分子结合，就能数倍放大体系内荧光分子复合物体积，荧光分子运动速率减缓从而放大体系的荧光偏振信号。因此，本专利技术将滚环扩增信号扩增技术与荧光偏振技术相结合进一步提高了检测ota的灵敏度。
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1.一种基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，phi29 DNA聚合酶的用量为0.05-0.1U。
3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第一步中，连接成环的反应时间为15-60min。
4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第一步中，连接成环的反应体系温度≤37℃。
5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，HH的实验浓度10-20nM。
6.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，dNTPs的浓度为10-20μM。
7.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，RCA反应时间1-3小时。
8.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法
9.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第二步中，引物的浓度＜20nM。
10.根据权利要求1-9任一权利要求所述的荧光偏振分析方法在检测产品中赭曲霉毒素A的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，phi29 dna聚合酶的用量为0.05-0.1u。
3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第一步中，连接成环的反应时间为15-60min。
4.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第一步中，连接成环的反应体系温度≤37℃。
5.根据权利要求1所述的基于滚环扩增核酸信号放大的荧光偏振分析方法，其特征在于，第三步中，hh的实验浓度10-20nm。
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晶瑾，田甜，张怡雯，张亮亮，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：
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