【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种长链二元酸的生物制备方法。
技术介绍
1、长链二元酸（long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称dcn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品。同时也是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等重要原料。
2、生物转化制备长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的两个甲基，氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。与传统的生物发酵模式相似，长链二元酸制备过程需要经过菌种扩大培养、生物发酵两个阶段。由于长链二元酸发酵属于长周期发酵，一般发酵时长为120h以上，因此发酵周期内菌种受环境影响，生物总量、对底物的转化活性难以维持较高水平。目前通过发酵过程调控，不断优化发酵体系参数，从而避免菌种出现延滞期，减少因菌种二次生长产生的平均生产强度低的问题。
3、常规的发酵调控主要涉及温度、溶氧、ph等关键参数，cn111349664a、cn111349660a在发酵过程中采用ph梯度调节的方式，优化了发酵体系中产物浓度构成，提高了菌种的发酵活性，提高了发酵水平。在长链二元酸发酵体系中，由于液蜡、烷烃的非极性特征，很难在水相培养体系中被微生物利用，同时由于培养周期较短，生物量较低，菌体细胞很难与液蜡、烷烃有效接触，因此相对于产物
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种长链二元酸的生物制备方法。本专利技术通过对发酵底物的预处理，进一步围绕菌种细胞、预处理底物构建了催化单元，实现了底物浓度相对稳定，利于提高生产强度。
2、本专利技术的一种长链二元酸的生物制备方法，包括如下内容：
3、（1）将非极性大孔载体加入到含有调和剂和烷烃的浸渍液中，进行浸渍处理，得到浸渍混合物；
4、（2）将活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，在培养后期加入步骤（1）制备的浸渍混合物，并通过ph调控方式，促进菌种生物量扩增，进一步获得发酵菌种的种子液；
5、（3）将发酵菌种的种子液加入到发酵培养基中，进行好氧发酵，当发酵体系ph值自动降至3.5~4.5时，加入步骤（1）制备的固定化发酵底物，依次进行酸性调节和碱性调节，生物催化获得长链二元酸。
6、本专利技术方法中，步骤（1）所述的非极性大孔载体为非极性多孔微载体和/或非极性大孔吸附树脂，如聚丙烯酰胺微球、乙基纤维素微球、树脂微球等中的一种或多种；非极性大孔载体的粒径范围0.3-5mm，优选为1.5~4mm，平均孔径0.02～30μm，优选为2~25μm 。
7、本专利技术方法中，步骤（1）所述的烷烃为具有11～16个碳原子的烷烃，优选十二碳烷烃。
8、本专利技术方法中，步骤（1）所述的调和剂为生物基大分子或长链脂肪酸，生物基大分子选自海藻酸钠、壳多糖等中的一种或多种；长链脂肪酸优选十二碳以上脂肪酸，进一步优选为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸中的一种或多种。
9、本专利技术方法中，步骤（1）所述的浸渍液由调和剂和烷烃组成，调和剂与烷烃混合的质量比为1:5～1:50，优选1:10～1:20。
10、本专利技术方法中，步骤（1）所述的浸渍处理是指将无菌处理后的非极性大孔载体浸泡在浸渍液中，非极性大孔载体与浸渍液的质量比为1:1～1:5，优选1:2～1:3；其中浸渍温度25℃～40℃，浸渍时间3h～10h。
11、本专利技术方法中，步骤（2）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌种加入种子培养基中，经培养获得发酵种子液。其中培养温度为25～37℃，优选28～35℃，培养时间为15～48h。
12、本专利技术方法中，步骤（2）所述的培养基为蔗糖5～15g/l、玉米浆1～2g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.5～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l。
13、本专利技术方法中，步骤（2）扩大培养过程中，利用菌种的代谢特征，ph值自然降至酸性条件，培养后期即当ph降低至3～4.5加入步骤（1）制备的浸渍混合物。浸渍混合物的添加量以烷烃计，种子培养总体积的质量浓度计算，烷烃质量浓度为20g/l～100g/l，优选40g/l～80g/l；。
14、本专利技术方法中，步骤（2）加入浸渍混合物后，进行ph进行调节，ph值为3～5，优选3.5～4.5。
15、本专利技术方法中，步骤（3）所述的发酵培养基为蔗糖20～28g/l、玉米浆0.8～1.5g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.8～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l、尿素1.2～4.8g/l，硫酸铵1.5～2.0g/l、醋酸钠1.5～1.8g/l。
16、本专利技术方法中，步骤（3）所述的好氧发酵条件为：发酵种子液接种量为5%～30%，优选10%～20%；温度为25～37℃，优选28～35℃；空气通气量为0.2～1.0vvm，优选0.5～1.0vvm；发酵时间为144～168小时。
17、本专利技术方法中，步骤（3）采用通气搅拌式生物反应器，搅拌转数100～700rpm，优选150～500rpm。
18、本专利技术方法中，步骤（3）发酵初期利用菌种有机酸产酸代谢特征，使发酵体系ph值自动降至3.5~4.5时，加入步骤（1）制备的固定化发酵底物。固定化发酵底物的添加量以固定化发酵底物吸附的烷烃质量浓度计算，烷烃质量浓度为100g/l～200g/l，优选150g/l～180g/l。
19、本专利技术方法中，步骤（3）所述的酸性调节的ph范围为4～5.5，优选4.5～5，ph酸性调节时间为12h～24h。ph调节剂一般为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等，优选氢氧化钠。
20、本专利技术方法中，步骤（3）所述的碱性调节的ph范围为7.0～8.5，优选7.2～8.2。所述的碱性调节剂一般为氢氧化钠、氢氧化钠钾、氨水等，优选氢氧化钠。
21、本专利技术方法中，步骤（3）碱性调节阶段优选采用梯度调节，具体方法为：酸性调控结束后，将体系ph调至7.0，随后每间隔24小时将ph增加0.1～0.2，直至发酵结束。
22、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
23、（1）针对发酵过程中发酵底物分布不均匀，影响发酵效率的问题，经过特定的烷烃处理方法，采用非极性大孔载体，提高烷烃底物的分散状态，实现了诱导物烷烃在水相体系中的可控分散，克服了烷烃作为有机相在水相中溶解度差、分散效果差的不足。
24、（2）利用发酵菌体细胞特点，结合长链二元酸发酵规律，利用烷烃固定化，选择特定载体及调和组分，分子层面形成了烷烃缓冲体系，实现了烷烃消耗的可控性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种长链二元酸的生物制备方法，其特征在于包括如下内容：（1）将非极性大孔载体加入到含有调和剂和烷烃的浸渍液中，进行浸渍处理，得到浸渍混合物；（2）将活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，在培养后期加入步骤（1）制备的浸渍混合物，并通过pH值调控方式，促进菌种生物量扩增，进一步获得发酵菌种的种子液；（3）将发酵菌种的种子液加入到发酵培养基中，进行好氧发酵，当发酵体系pH值自动降至3.5~4.5时，加入步骤（1）制备的固定化发酵底物，依次进行酸性调节和碱性调节，生物催化获得长链二元酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的非极性大孔载体为非极性多孔微载体和/或非极性大孔吸附树脂，优选聚丙烯酰胺微球、乙基纤维素微球、树脂微球中的一种或多种；非极性大孔载体的粒径范围0.3-5mm，优选为1.5~4mm，平均孔径0.02～30μm，优选为2~25μm 。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的调和剂为生物基大分子或长链脂肪酸，生物基大分子选自海藻酸钠、壳多糖中的一种或多种；长链脂肪酸为十二碳以上脂肪酸，进一步优选为月桂酸、
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的调和剂与烷烃混合的质量比为1:5～1:50，优选1:10～1:20。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的非极性大孔载体与浸渍液的质量比为1:1～1:5，优选1:2～1:3；其中浸渍温度25～40℃，浸渍时间3～10h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌种加入种子培养基中，经培养获得发酵种子液；其中培养温度为25～37℃，培养时间为15～48h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基为蔗糖5～15g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.5～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）扩大培养过程中，所述的培养后期为pH值降低至3～4.5时加入步骤（1）制备的浸渍混合物；浸渍混合物的添加量以烷烃计，种子培养总体积的质量浓度计算，烷烃质量浓度为20g/L～100g/L，优选40g/L～80g/L；。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）加入浸渍混合物后，调节pH值为3～5，优选3.5～4.5。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的发酵培养基为蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2.0g/L、醋酸钠1.5～1.8g/L。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的好氧发酵条件为：发酵种子液接种量为5%～30%，优选10%～20%；温度为25～37℃，优选28～35℃；空气通气量为0.2～1.0vvm，优选0.5～1.0 vvm；发酵时间为144～168小时。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）采用通气搅拌式生物反应器，搅拌转数100～700rpm，优选150～500rpm。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，加入步骤（1）制备的固定化发酵底物的添加量以固定化发酵底物吸附的烷烃质量浓度计算，烷烃质量浓度为100g/L～200g/L，优选150g/L～180g/L。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的酸性调节的pH值范围为4～5.5，pH值酸性调节时间为12h～24h。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的碱性调节的pH值范围为7.0～8.5，优选7.2～8.2；碱性调节阶段采用梯度调节，具体方法为：酸性调控结束后，将体系pH值调至7.0，随后每间隔24小时将pH值增加0.1～0.2，直至发酵结束。
...【技术特征摘要】
1.一种长链二元酸的生物制备方法，其特征在于包括如下内容：（1）将非极性大孔载体加入到含有调和剂和烷烃的浸渍液中，进行浸渍处理，得到浸渍混合物；（2）将活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，在培养后期加入步骤（1）制备的浸渍混合物，并通过ph值调控方式，促进菌种生物量扩增，进一步获得发酵菌种的种子液；（3）将发酵菌种的种子液加入到发酵培养基中，进行好氧发酵，当发酵体系ph值自动降至3.5~4.5时，加入步骤（1）制备的固定化发酵底物，依次进行酸性调节和碱性调节，生物催化获得长链二元酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的非极性大孔载体为非极性多孔微载体和/或非极性大孔吸附树脂，优选聚丙烯酰胺微球、乙基纤维素微球、树脂微球中的一种或多种；非极性大孔载体的粒径范围0.3-5mm，优选为1.5~4mm，平均孔径0.02～30μm，优选为2~25μm 。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的调和剂为生物基大分子或长链脂肪酸，生物基大分子选自海藻酸钠、壳多糖中的一种或多种；长链脂肪酸为十二碳以上脂肪酸，进一步优选为月桂酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的调和剂与烷烃混合的质量比为1:5～1:50，优选1:10～1:20。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的非极性大孔载体与浸渍液的质量比为1:1～1:5，优选1:2～1:3；其中浸渍温度25～40℃，浸渍时间3～10h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌种加入种子培养基中，经培养获得发酵种子液；其中培养温度为25～37℃，培养时间为15～48h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的种子培养基为蔗糖5～15g/l、玉米浆1～2g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.5～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l。
...【专利技术属性】
技术研发人员：张霖，樊亚超，师文静，廖莎，李晓姝，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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