【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学，特别涉及一种用于黑曲霉属毒素检测的重组酶聚合酶扩增引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、石槌黑茶是日本一款著名的后发酵茶，有多种益生作用。它是在日本本土自然发酵生产的，发酵依赖于茶叶或生产环境中的微生物。石槌黑茶在自然发酵过程中，首先进行真菌的有氧发酵，然后通过乳酸菌的厌氧发酵进行第二次发酵。通过对比茶叶发酵前后菌种多样性的变化，研究者发现能够产生真菌毒素(mycotoxin)的黑曲霉(aspergillusniger)也会参与到石槌黑茶的第一次发酵中(li z,jiang l,wei l,et al.bioscibiotechnol biochem,2022,86(1):117-124)，对于茶叶消费者而言存在食品安全隐患。甚至日本市售的三款茶产品中也能检测到黑曲霉基因(mizuno t,iwahashi h,horie m.jjapan soc taste technol 2020；19:46-52)。中国拥有较多类型的后发酵茶，有广西六堡茶、湖南黑茶(茯茶、千两茶、黑砖茶、三尖等)、湖北青砖茶、四川边茶、安徽古黟黑茶(安茶)、云南黑茶(普洱茶)、及陕西黑茶(茯茶)、康砖金尖等。后发酵茶之间有着类似的发酵工艺，其他后发酵茶在生产中同样可能有黑曲霉的参与。在茶工业中，黑曲霉常被认为是有益菌，然而研究指出自然界存在产毒黑曲霉，其主要真菌毒素为赭曲霉毒素a(ochratoxina,ota)与伏马毒素b2(fumonisinb2,fb2)，均为致癌物质(célia soares c,calado t,a.r
2、常用于食源性微生物检测的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)技术，是目前大部分检测机构及实验室都在使用的常规技术，该技术也为黑曲霉的检测手段之一(susca a,stea g,mule g et al.food addit contam,2007；24:1154-1160)。然而该技术需要昂贵且精密的控温设备，耗费较长时间，在现场检测中不具备优势，因此，我们需要更加简便的技术来提高检测效率。rpa技术全称重组酶聚合酶等温核酸扩增技术，是pcr的一种替代品，可快速、便携地进行核酸检测分析。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。rpa反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快基因扩增的速度。rpa技术对引物的设计具有较高的要求，如最适引物长度在30～35bp之间，胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)含量应控制在30～70％。合适的引物将进一步增加该技术的灵敏度及便捷性(lobato im,o'sullivan ck.trends analyt chem 2018；98:19-35)。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于黑曲霉属毒素检测的重组聚合酶等温扩增引物、试剂盒及其应用。用于常温下识别产毒黑曲霉及产毒类型，有助于后发酵茶加工过程中的条件控制。
2、本专利技术首先提供了用于检测黑曲霉属毒素的多重rpa引物组合，用于检测检测黑曲霉赭曲霉毒素a(ota)、黑曲霉伏马毒素b2(fb2)、黑曲霉属a.niger。
3、本专利技术提供了用于检测黑曲霉赭曲霉毒素a(ota)的引物：
4、正向引物：5’-aagtaccatgagaaatacaaggaacgcaacc-3’
5、反向引物：5’-attgacatacagctattacagtgtaccgcg-3’
6、目标基因名称：anotabzip，产物长度：230bp。
7、本专利技术提供了用于检测黑曲霉伏马毒素b2(fb2)的引物：
8、正向引物：5’-gtaggcatcccatagcctctataatacctaca-3’
9、反向引物：5’-tgacctcctaagcagcggcgtttaccatag-3’。
10、目标基因名称：a-oxoamine synthase fum8，产物长度：306bp。
11、本专利技术提供了用于检测黑曲霉属a.niger的引物：
12、正向引物：5’-atctccaattcggctcctactggcaaggtc-3’
13、反向引物：5’-caaacggggacagaagaaaacaccgaactg-3’。
14、目标基因名称：arabinan endo-1,5-alpha-l-arabinosidase c，产物长度：452bp。
15、本专利技术还提供了一种用于检测黑曲霉属毒素的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组合，以及twistamptmexo试剂盒中的rpa冻干酶粉反应管(内含重组酶、单链结合蛋白、聚合酶及内切酶3)。
16、本专利技术还提供了用于黑曲霉属毒素的检测方法，具体检测方法如下：提取待测样品的dna，并对dna定量分析；以待测样品的dna为模板，利用试剂盒所包含的引物及蛋白和酶类对进行rpa扩增反应；将扩增产物和核酸分子量参照物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。
17、对目标产物凝胶电泳结果判定是否含有目标基因：如在230bp处出现条带，则表示待测样品中含有赭曲霉毒素a基因；如在306bp处出现条带，则表示待测样品中含有伏马毒素b2(fb2)基因；如在452pb处出现条带，则表示待测样品中含有arabinan endo-1,5-alpha-l-arabinosidase c基因，该待测微生物为黑曲霉菌属。
18、上述检测方法中，扩增反应体系为：反应须在twistamptmexo试剂盒中的rpa冻干酶粉反应管中进行，另需添加10μl dntp、2μl模板dna、28.5μltwistamptmexo试剂盒中的再水化缓冲液、4μl去离子水、混合正、反向引物各1.5μl、2.5μl 280mm乙酸镁，扩增的反应参数为：37℃，15min。
19、混合正、反向引物分别由三对浓度为1μmol/l的正、反向引物按体积比1:1:1混合而成。
20、本专利技术的有益效果：
21、1.相较于黑曲霉的常规pcr扩增，利用本专利技术进行的rpa扩增，在常温下即可高速扩增，适用于现场检测。
22、2.识别能力强，可特异性检出样品中是否含有产毒黑曲霉，且能同时识别出多种产毒基因，避免了检测结果错误，提高了检本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测黑曲霉属毒素的多重RPA引物组合，其特征在于，所述多重RPA引物和探针的序列如下：
2.一种用于检测黑曲霉属毒素的RPA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的多重RPA引物组合。
3.一种用于黑曲霉属毒素的检测方法，其特征在于，提取待测样品的DNA，并对DNA定量分析；以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行RPA扩增反应；将扩增产物与核酸分子量参照物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
4.根据权利要求3所述的用于黑曲霉属毒素的检测方法，其特征在于，所述RPA扩增反应在TwistAmp™ exo试剂盒中的RPA冻干酶粉反应管中进行，添加10μL dNTP、2μL DNA、28.5μLTwistAmp™ exo试剂盒中的再水化缓冲液、4μL去离子水、混合正、反向引物各1.5μL、2.5 μL 280mM 乙酸镁，扩增的反应参数为：37℃，15min。
5.根据权利要求4所述的用于黑曲霉属毒素的检测方法，其特征在于，扩增反应体系中正向引物为权利要求1所述的正向引物稀释到浓度1μmol/L，按体积比1:
6.一种如权利要求1所述的用于检测黑曲霉属毒素的多重RPA引物组合的应用，其特征在于，所述多重RPA引物组合用于检测黑曲霉赭曲霉毒素A、黑曲霉伏马毒素B2、黑曲霉属A. niger的arabinan endo-1,5-alpha-L-arabinosidase C基因。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测黑曲霉属毒素的多重rpa引物组合，其特征在于，所述多重rpa引物和探针的序列如下：
2.一种用于检测黑曲霉属毒素的rpa试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的多重rpa引物组合。
3.一种用于黑曲霉属毒素的检测方法，其特征在于，提取待测样品的dna，并对dna定量分析；以待测样品的dna为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行rpa扩增反应；将扩增产物与核酸分子量参照物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
4.根据权利要求3所述的用于黑曲霉属毒素的检测方法，其特征在于，所述rpa扩增反应在twistamp™ exo试剂盒中的rpa冻干酶粉反应管中进行，添加10μl dntp、2μl dna、28.5μltwistamp™ exo试剂...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋磊，郝卫强，蒋婧，徐瑾，徐成余，吕欣桐，朱逸滢，毛成超，
申请(专利权)人：常州工程职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。