【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物多糖，具体涉及一种高产球孢白僵菌胞外多糖的菌株及其应用。
技术介绍
1、多糖是普遍存在于动植物及微生物中的一类大分子，研究发现其具有广泛的生物活性，能够抗肿瘤、抗放射、抗炎，同时还具有抗衰老、降血脂、降血糖以及促进伤口愈合等重要功能，已成为一种良好的生物效应调节剂，因而成为近年来研究的热点。其中，微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式：①黏附在细胞表面上，即胞壁多糖；②分泌到培养基中，即胞外多糖(extracellular polysaccharides，eps)；③构成微生物细胞的成分，即胞内多糖；而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产优势。微生物胞外多糖是微生物在生长过程中为适应周围环境的变化产生的一种对自身具有保护作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和植物多糖相比较具有以下优势：①生产周期短，不受季节、地域、病虫害等条件的限制；②具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景；③应用广泛。目前已有多种微生物胞外多糖已经发展成为一类新型的发酵产品，作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、保湿剂、胶凝剂、悬浮剂等广泛应用于石油、化工、食品和制药等多个领域。近年来有关海洋微生物和乳酸菌微生物胞外多糖研究活跃，不断有新型多糖结构被鉴定。微生物多糖作为天然活性大分子，在生物医药领域的潜在应用价值也日益受到人们的广泛关注。新菌种的进一步探索成为新型胞外多糖的一个重要来源。
2、球孢白僵菌(beauveria bassiana)是一种昆虫病原真菌，能够产生多种天然活性产物，包括白僵菌素、卵孢素、纤
3、随机突变结合定向筛选是获得天然产物高产菌株的常用方法，目前已有多种产物通过随机突变获得高产菌株，例如非达霉素生产菌株及吡咯喹啉醌高产菌株等。鉴于多糖的应用价值较高，如果能够通过随机突变获得球孢白僵菌多糖高产菌株，对于多糖的大规模生产无疑意义重大的。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本专利技术通过农杆菌介导的t-dna插入获得大量突变体，并结合苯酚-硫酸显色法，筛选能够高效产生多糖的突变体，最终获得一株能够高效合成真菌胞外多糖的菌株，该突变菌株与野生型相比，其发酵液中胞外多糖的产量可提高450倍，产量达到500-650mg/l，有望用于真菌多糖的大量生物合成，解决球孢白僵菌多糖产量低，无法大规模生产等问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、本专利技术第一方面提供了一株高产胞外多糖的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株，所述t-bbpeps菌株于2023年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：gdmcc no:64180；所述t-bbpeps菌株的its(internal transcribed spacer)序列如seq idno：1所示。
4、本专利技术第二方面提供了第一方面所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株在制备微生物胞外多糖中的应用。
5、本专利技术通过t-dna随机插入筛选得到一株高产真菌胞外多糖bb-eps的球孢白僵菌突变菌株，命名为t-bbpeps，该突变体t-bbpeps与野生型球孢白僵菌相比，其发酵液中胞外多糖bb-eps产量提高450倍，产量达到500-650mg/l，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化生产打下基础。
6、本专利技术第三方面提供了一种发酵制备胞外多糖的方法，具体为：先将第一方面所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株的分生孢子接种于培养基中，于24-28℃、180-300rpm下培养2-4d作为种子液，再将种子液置于于24-28℃、180-300rpm培养5-7d，即获得多糖发酵产物。
7、优选地，t-bbpeps菌株的分生孢子的获取方法为：将t-bbpeps菌株接种于pda培养基中，24-28℃下培养7-10d。
8、优选地，t-bbpeps菌株的分生孢子在接种前先用0.05％吐温-80配制成分生孢子悬液，并调整浓度至1-9×107conidial/ml，所述分生孢子悬液与培养基的比例为80-200μl:50ml。
9、优选地，所述培养基选自pdb培养基。
10、优选地，获得多糖发酵产物后，还包括分离纯化步骤：先通过离心去除菌体，并通过sevag法脱蛋白，进而通过乙醇沉淀法获得多糖，最后干燥多糖。
11、更优选地，通过sevag法脱蛋白具体为：先将多糖产物与sevag试剂混合，150-200rpm振荡1-3小时后7000-10000rpm离心7-15min，保留上清，获得脱蛋白多糖溶液。
12、更优选地，所述sevag试剂为氯仿：正丁醇＝4:1(v/v)，所述多糖产物与sevag试剂的体积比为4-6:1。
13、更优选地，通过乙醇沉淀法获得多糖具体为：在搅拌状态下往脱蛋白多糖溶液中加入无水乙醇，至乙醇体积分数为55-65％，于4℃静置沉淀8-12小时，即得多糖。
14、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
15、常规培养条件下，球孢白僵菌无法产生或产生极少量的胞外多糖bb-eps。为此，本专利技术通过t-dna插入的方法获得球孢白僵菌随机插入突变体库，结合苯酚-硫酸法筛选得到一株高产胞外多糖的突变菌株，并将其命名为t-bbpeps。该菌株能够在常规pdb培养基中高产球孢白僵菌胞外多糖(bb-eps)，与野生型球孢白僵菌相比，其发酵液中胞外多糖bb-eps产量提高450倍，产量达到500-650mg/l，为球孢白僵菌胞外多糖的规模化生产打下基础。同时，本专利技术针对bb-eps建立了高效、简便的高纯度多糖的生产提纯方法，为球孢白僵菌胞外多糖的大量合成及提纯提供了一个经济、高效的方案。
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1.一株高产胞外多糖的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株，其特征在于，所述T-BbPeps菌株于2023年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No:64180；所述T-BbPeps菌株的ITS序列如SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株在制备微生物胞外多糖中的应用。
3.一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，先将权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)T-BbPeps菌株的分生孢子接种于培养基中，于24-28℃、180-300rpm下培养2-4天作为种子液，再将种子液置于24-28℃、180-300rpm培养5-7d，即获得多糖发酵产物。
4.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，T-BbPeps菌株的分生孢子的获取方法为：将T-BbPeps菌株接种于PDA培养基中，24-28℃下培养7-10d。
5.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外
6.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述培养基选自PDB培养基。
7.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，获得多糖发酵产物后，还包括分离纯化步骤：先通过离心去除菌体，并通过Sevag法脱蛋白，进而通过乙醇沉淀法获得多糖，最后干燥多糖。
8.根据权利要求7所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，通过Sevag法脱蛋白具体为：先将多糖产物与Sevag试剂混合，150-200rpm振荡1-3小时后7000-10000rpm离心7-15min，保留上清，获得脱蛋白多糖溶液。
9.根据权利要求8所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，所述Sevag试剂为氯仿：正丁醇＝4:1(v/v)，所述多糖产物与Sevag试剂的体积比为4-6:1。
10.根据权利要求7所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，通过乙醇沉淀法获得多糖具体为：在搅拌状态下往脱蛋白多糖溶液中加入无水乙醇，至乙醇体积分数为55-65％，于4℃静置沉淀8-12小时，即得多糖沉淀。
...【技术特征摘要】
1.一株高产胞外多糖的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株，其特征在于，所述t-bbpeps菌株于2023年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：gdmcc no:64180；所述t-bbpeps菌株的its序列如seq id no：1所示。
2.权利要求1所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株在制备微生物胞外多糖中的应用。
3.一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，先将权利要求1所述的球孢白僵菌(beauveria bassiana)t-bbpeps菌株的分生孢子接种于培养基中，于24-28℃、180-300rpm下培养2-4天作为种子液，再将种子液置于24-28℃、180-300rpm培养5-7d，即获得多糖发酵产物。
4.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，t-bbpeps菌株的分生孢子的获取方法为：将t-bbpeps菌株接种于pda培养基中，24-28℃下培养7-10d。
5.根据权利要求3所述的一种发酵制备胞外多糖的方法，其特征在于，t-bbpeps菌株的分生孢子在接种前先用0.05％吐温-80配制成分生孢...
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