【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，具体涉及一种发酵制备长链二元酸的方法。
技术介绍
1、长链二元酸（long chain dicarboxylic acids）是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二羧酸（简称dcn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品。同时也是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温电介质、高级油漆和涂料、高级润滑油、耐寒性增塑剂、树脂、医药和农药等重要原料。
2、发酵法生产长链二元酸是利用微生物特有的氧化能力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷烃两端的两个甲基，氧化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。目前长链二元酸发酵符合经典的好氧发酵模式，其过程主要采用通气式反应器，同时通过较高转数的搅拌控制，提高传质效果。但是正构烷烃存在挥发性，在通气式反应器中，烷烃会随尾气从发酵体系中排出，从而降低了底物烷烃的转化率。中国专利cn102115768a公开了一种微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法，其通过添加表面活性剂吐温60 0.1～2g/l以增强油相的乳化效果。中国专利cn102115768a公开了一种微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法，其通过在60、90、120小时补加正十六烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%（v/v）。中国专利cn103805643a公开一种生产长链二元酸的方法，在发酵过程中加入乳化烷烃，改善了发酵体系中水相和油相间的相容性，提高了发酵体系中烷烃的转化率和二元酸产品的收率。上述方案虽然
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种发酵制备长链二元酸的方法。本专利技术利用烷烃底物密度低、发酵菌种细胞具有悬浮性的特征，通过添加适当的载体，结合发酵调控方案，在微生物细胞水平优化了催化微环境，有利于提高发酵水平。
2、本专利技术的生物发酵制备长链二元酸的方法，包括如下内容：
3、（1）活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，并通过ph调控方式，进行菌种活化，进一步获得发酵菌种的种子液；
4、（2）将步骤（1）得到的种子液加入到发酵培养基中，采用好氧发酵模式制备得到长链二元酸；发酵过程分为酸性调节阶段和碱性调节阶段，在碱性调节阶段加入活化载体和底物烷烃。
5、本专利技术方法中，步骤（1）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌接种至发酵培养基中培养获得种子液，其中培养温度为25～37℃，优选28～35℃，培养时间为15～48h。
6、本专利技术方法中，步骤（1）所述的培养基为蔗糖5～15g/l、玉米浆1～2g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.5～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l。
7、本专利技术方法中，步骤（2）所述的发酵培养基为蔗糖20～28g/l、玉米浆0.8～1.5g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.8～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l、尿素1.2～4.8g/l，硫酸铵1.5～2.0g/l、醋酸钠1.5～1.8g/l。
8、本专利技术方法中，步骤（2）所述的好氧发酵条件为：发酵种子液接种量为5%～30%，优选10%～20%；温度为25～37℃，优选28～35℃；空气通气量为0.5～1.2vvm，优选0.8～1vvm；发酵时间为144～168小时。
9、本专利技术方法中，步骤（1）所述的烷烃为具有11～16个碳原子的烷烃，优选十二碳烷烃。
10、本专利技术方法中，步骤（2）采用通气搅拌式生物反应器，搅拌转数100～700rpm，优选150～500rpm。
11、本专利技术方法中，步骤（2）所述的酸性调节的ph范围为4～5.5，优选4.5～5，ph酸性调节时间为12h～24h。ph调节剂一般为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等，优选氢氧化钠。
12、本专利技术方法中，步骤（2）所述的碱性调节的ph范围为7.0～8.5，优选7.2～8.2。所述的碱性调节剂一般为氢氧化钠、氢氧化钠钾、氨水等，优选氢氧化钠。
13、本专利技术方法中，步骤（2）碱性调节阶段优选采用梯度调节，具体方法为：酸性调控结束后，将体系ph调至7.0，随后每间隔24小时将ph增加0.1～0.2，直至发酵结束。
14、本专利技术方法中，步骤（2）碱性调节阶段，体系ph调至7.0时加入活化的固态载体和底物烷烃。活化载体的质量浓度为10g/l～100g/l，优选20g/l～80g/l，烷烃质量浓度为100g/l～200g/l，优选150g/l～180g/l。
15、本专利技术方法中，步骤（2）所述的固态载体为非极性多孔微载体和/或非极性大孔吸附树脂，如聚丙烯酰胺微球、乙基纤维素微球、树脂微球等中的一种或多种；非极性大孔载体的粒径范围0.3-5mm，优选为1.5~4mm，平均孔径0.02～30μm，优选为2~25μm 。
16、本专利技术方法中，步骤（2）所述的固态载体需要活化处理，具体包括浸渍和脱水。浸渍是指将无菌处理后的固态载体浸渍在过量的脂肪酸钠盐饱和溶液中，其中浸渍温度25℃～40℃，浸渍时间3h～10h。脂肪酸钠盐优选十二碳以上脂肪酸钠盐，进一步优选为月桂酸钠盐、棕榈酸钠盐、硬脂酸钠盐、油酸钠盐中的一种或多种。脱水是指将浸渍的固态载体经过滤或烘干处理，使含水率控制为2%~10%。
17、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
18、（1）针对长链二元酸发酵过程中产生的通气量大、烷烃损失大的问题，通过对发酵体系固液比例，改变了烷烃在发酵体系中的分散状态，有效降低了烷烃损失，相应提高了烷烃转化率。
19、（2）利用发酵过程中发酵菌种细胞密度低、菌体多悬浮于上层的特征，对固态载体进行活化处理，增加载体的极性，分子层面强化了菌体细胞与烷烃底物的接触，从而提高了发酵效率。
20、（3）本方案能够构建介尺度的催化活性区域，并优化了溶氧分布和催化单元分布，利于提高生产强度。本方案过程控制简单，适于工业应用。
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1.一种生物发酵制备长链二元酸的方法，其特征在于包括如下内容：（1）活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，并通过pH调控方式，进行菌种活化，获得发酵菌种的种子液；（2）将步骤（1）得到的种子液加入到发酵培养基中，采用好氧发酵模式制备得到长链二元酸；发酵过程分为酸性调节阶段和碱性调节阶段，在碱性调节阶段加入活化载体和底物烷烃。
2.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌接种至发酵培养基中培养获得种子液，其中培养温度为25～37℃，培养时间为15～48h。
3.根据权利要求是2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养基为蔗糖5～15g/L、玉米浆1～2g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.5～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2～1.8g/L。
4.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的发酵培养基为蔗糖20～28g/L、玉米浆0.8～1.5g/L、酵母膏2.0～4.0g/L、氯化钠0.8～1.2g/L、磷酸二氢钾3.0～3.5g/L、硫酸镁1.2
5.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的好氧发酵条件为：发酵种子液接种量为5%～30%，优选10%～20%；温度为25～37℃，优选28～35℃；空气通气量为0.5～1.2vvm，优选0.8～1vvm；发酵时间为144～168小时。
6.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的酸性调节的pH范围为4～5.5，pH酸性调节时间为12h～24h；所述的碱性调节的pH范围为7.0～8.5。
7.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：碱性调节采用梯度调节，具体方法为：酸性调控结束后，将体系pH调至7.0，随后每间隔24小时将pH增加0.1～0.2，直至发酵结束。
8.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）碱性调节阶段，体系pH调至7.0时加入活化的固态载体和底物烷烃；活化载体的质量浓度为10g/L～100g/L，烷烃质量浓度为100g/L～200g/L。
9.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的固态载体为非极性多孔微载体和/或非极性大孔吸附树脂，优选聚丙烯酰胺微球、乙基纤维素微球、树脂微球中的一种或多种；非极性大孔载体的粒径范围0.3-5mm，优选为1.5~4mm，平均孔径0.02～30μm，优选为2~25μm 。
10.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的活化的固态载体的活化处理方法包括浸渍和脱水；其中浸渍是指将无菌处理后的固态载体浸渍在过量的脂肪酸钠盐饱和溶液中，其中浸渍温度25℃～40℃，浸渍时间3h～10h；脂肪酸钠盐优选十二碳以上脂肪酸钠盐，进一步优选为月桂酸钠盐、棕榈酸钠盐、硬脂酸钠盐、油酸钠盐中的一种或多种；脱水是指将浸渍的固态载体经过滤或烘干处理，使含水率为2wt%~10wt%。
...【技术特征摘要】
1.一种生物发酵制备长链二元酸的方法，其特征在于包括如下内容：（1）活化的长链二元酸发酵菌进行扩大培养，并通过ph调控方式，进行菌种活化，获得发酵菌种的种子液；（2）将步骤（1）得到的种子液加入到发酵培养基中，采用好氧发酵模式制备得到长链二元酸；发酵过程分为酸性调节阶段和碱性调节阶段，在碱性调节阶段加入活化载体和底物烷烃。
2.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的扩大培养是指将活化的长链二元酸发酵菌接种至发酵培养基中培养获得种子液，其中培养温度为25～37℃，培养时间为15～48h。
3.根据权利要求是2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的培养基为蔗糖5～15g/l、玉米浆1～2g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.5～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l。
4.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的发酵培养基为蔗糖20～28g/l、玉米浆0.8～1.5g/l、酵母膏2.0～4.0g/l、氯化钠0.8～1.2g/l、磷酸二氢钾3.0～3.5g/l、硫酸镁1.2～1.8g/l、尿素1.2～4.8g/l，硫酸铵1.5～2.0g/l、醋酸钠1.5～1.8g/l。
5.根据权利要求是1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的好氧发酵条件为：发酵种子液接种量为5%～30%，优选10%～20%；温度为25～37℃，优选28～35℃；空气通气量为0.5～1.2vvm，优选0.8～1vvm；发酵时...
【专利技术属性】
技术研发人员：张霖，樊亚超，师文静，廖莎，李晓姝，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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