【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学技术和基因重组领域，尤其是本专利技术涉及一种毕赤酵母生产的重组人源iii型胶原蛋白及其应用。
技术介绍
1、胶原蛋白(collagen)是人体内含量最多的一种蛋白质，是细胞外基质(ecm)的主要成分，也是人体中含量最多的蛋白质，占到蛋白质总量的25％至35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能和修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料无法比拟的优异的生物组织相容性，对细胞的支撑弹性和可降解性，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复具有重要作用，已广泛应用于医药、保健品及化妆品行业中。
2、当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中，很难避免病毒感染，会导致免疫排斥和过敏症状，天然胶原蛋白无法溶于水，性质不均一，难以被人体利用，往往需要经过化学手段处理后才能使用。会导致免疫排斥和过敏症状。所以，目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用，无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。随着生物技术的发展，利用基因重组技术，通过微生物发酵法获得重组胶原蛋白，解决了传统提取法存在的病毒隐患，同时与天然胶原蛋白相比，人工设计的重组胶原蛋白的亲水性和生物相容性显著提高。
3、但研究表明利用重组菌株，大肠杆菌表达表达的胶原蛋白无法进行蛋白翻译后修饰，对于一些具有高级构象的重组人胶原蛋白，利用大肠杆菌表达后无法糖基化。同时，由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网(er)，因此也没有能帮助胶原蛋白质折叠成高级构象的分子伴侣蛋白及一些修饰合成蛋
4、酵母发酵产生的人源重组胶原蛋白克服了动物源以及大肠杆菌表达的胶原蛋白的缺陷。酵母表达系统具备分子伴侣以及蛋白翻译后修饰的酶(如糖基化、羟基化、乙酰基化酶等)，非常适合于具有高级结构的三螺旋胶原蛋白的形成。酵母细胞的培养条件相对于哺乳动物细胞较低，非常适宜于大规模的工业化发酵生产。酵母系统取代动物源胶原和大肠杆菌原核表达系统源重组胶原在生物医学应用方面有重要研究价值。
5、随着invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构。近些年，毕赤酵母被美国fda认定为generally recognized as safe(gras)微生物，使得毕赤酵母在食品领域具备极大的应用潜力。毕赤酵母目前常用的表达质粒根据不同的启动子分为ppic系列甲醇诱导型表达载体(如ppic3.5k、ppic9k、ppicz、pao815等)和pgap系列组成型表达载体。其中ppic系列质粒含醇氧化酶(aox)启动子，该启动子是以甲醇为唯一诱导物并受其严谨控制的强启动子，由于aox表达是受转录水平调控的，其强诱导型启动子aox能非常有效地控制外源基因的表达。但其也有不足之处，毕赤酵母在不受控制的条件下细胞先生长至高密度，然后通过甲醇诱导启动外源蛋白表达，这增加了工程菌的培养时间和工作量。同时在大规模生产过程中，甲醇的使用也存在诸多弊端，如易挥发、安全隐患、具有毒性、不适于药品和食品蛋白的生产等，因而制约了毕赤酵母表达系统的大规模应用。pgap系列质粒含3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)启动子，gap启动子受碳源调控，组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺简单，具有适合于食品规模化应用的优势。但是相对于aox启动子gap启动子表达外源蛋白的水平较低，本专利技术通过加入酵母自主ars元件，将gap质粒改造为高拷贝游离型表达载体，既可以安全无毒地生产重组人源iii型胶原蛋白，又通过可以极大提高重组人源iii型胶原蛋白的产量。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种重组人源ⅲ型胶原蛋白及其应用。该重组蛋白具有三级螺旋结构，显现出更强的稳定性，且具有接近天然胶原的性质。
2、一种毕赤酵母的安全型非甲醇游离型自主复制高拷贝pgapzαa-ars载体，将gap质粒改造为高拷贝游离型表达载体，可以安全、高产量地生产目的重组蛋白。
3、一种重组人源ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；或具有在seq id no.1所示氨基酸序列中取代、缺失或添加氨基酸且蛋白功能相同的氨基酸序列。
4、一些实施方案中，所述取代、缺失或添加的氨基酸为一个或多个。
5、本专利技术还提供了编码所述重组人源ⅲ型胶原蛋白的核酸。
6、一些实施方案中，编码seq id no.1所示所述重组人源ⅲ型胶原蛋白的核酸的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7、本专利技术还提供一种重组载体，包含本专利技术所述核酸。
8、本专利技术中，所述重组载体还包括骨架载体；其中，所述骨架载体优选为pgapzαa。
9、本专利技术还提供了转化有所述重组载体的宿主。
10、本专利技术还提供了所述的重组人源ⅲ型胶原蛋白、权利要求5所或6所述的核酸、所述的重组载体或所述的宿主，在制备抗衰老、保湿产品中的应用。
11、本专利技术还提供了一种产品，包括本专利技术所述的重组人源ⅲ型胶原蛋白。
12、本专利技术中，所述产品的剂型为粉末固体、后续可加工为粉针剂、颗粒剂、口服液、注射液或胶囊。
13、本专利技术提供的重组人源ⅲ型胶原蛋白，具有如seq id no.1所示的氨基酸序列；或具有在seq id no.1所示氨基酸序列中取代、缺失或添加氨基酸且蛋白活性不发生改变的氨基酸序列。该胶原蛋白具有三级螺旋结构，显现出较好的稳定性，且具有接近天然胶原的性质，可以在毕赤酵母中有效稳定和大量表达，易于获得高纯度产品，能够适应于工业化的大规模生产。
14、表1、seq id no.1氨基酸序列、seq id no.2核苷酸序列：
15、
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1.一种重组人源III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一种游离型高表达pGAPZαA-ARS载体，其中，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的胶原蛋白或权利要
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。
8.一种制备权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用权利要求5-7中任一项所述的宿主细胞表达所述重组人源III型胶原蛋白，然后进行分离纯化得到。
9.根据权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白，或根据权利要求2或3所述的核酸分
10.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括根据权利要求1所述的重组人源III型胶原蛋白，或根据权利要求2或3所述的核酸分子编码的重组人源III型胶原蛋白，或由根据权利要求5-7中任一项所述的宿主细胞产生的重组人源III型胶原蛋白。
11.一种权利要求10的组合物在制备食品、化妆品或药械产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组人源iii型胶原蛋白，其特征在于，所述重组人源iii型胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组人源iii型胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如seq id no. 2所示。
4.一种游离型高表达pgapzαa-ars载体，其中，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的胶原蛋白或权利要
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。
8.一种制备权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾萌萌，请求不公布姓名，潘韵芝，徐永吉，
申请(专利权)人：苏州原美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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