【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和生物医学领域，尤其涉及一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用。
技术介绍
1、轮状病毒(rotavirus，rv)属于呼肠孤病毒科(reoviridae)，通过粪口途径传播，主要感染小肠上皮细胞，轮状病毒属于双链(ds)rna病毒，其基因组由11条分节段的dsrna组成，随着分子生物学技术的进步，许多轮状病毒株11条dsrna的核苷酸序列被获得，来自不同毒株的序列显示出了共同特征。轮状病毒的11条dsrna共编码12种蛋白，包括6种结构蛋白(vp1～vp4，vp6和vp7)和6种非结构蛋白(nsp1～nsp6)，它们各自在轮状病毒的感染、复制、表达及组装过程中发挥不同的作用。
2、当应用于病毒时，“反向遗传学”描述了一种从纯化的dna或rna生成病毒的策略。这种方法的优点是操纵用于转染dna或rna收获具有感染能力的重组或重配病毒，这一过程通常又被称为病毒拯救(rescue of virus)。几乎所有的基因工程技术均以dna为操作对象，因此，dna病毒的反向遗传学技术比较容易。相对而言，rna病毒的反向遗传学技术则更为复杂，而且不同rna病毒的反向遗传学技术差异也很大。呼肠孤病毒科病毒由多层衣壳蛋白组成复杂的三维空间结构，其基因组由10～12条分节段的双链rna组成，病毒基因组的复杂性使得呼肠孤病毒科病毒的感染性克隆构建十分困难。其次，各基因组节段具有特异性分配特点，并且对外来的同源基因节段具有排斥性，这一特性也限制了对呼肠孤病毒科病毒基因组的修饰和操作。因此，呼
3、nsp1已被证明对细胞培养中病毒的复制不是必须的。nsp1可以耐受外源基因的插入，并且具有作为外源基因表达载体的潜力。但是，nsp1在感染细胞中的表达水平较低，并且易发生蛋白酶体降解，因而，外源基因的表达量也不高。此外，以改变nsp1 orf的方式插入外源基因，可能会损害nsp1蛋白作为干扰素拮抗剂的功能，从而影响病毒的生物学特性。nsp3的c末端插入荧光报告基因的第二代报告病毒，nsp3的orf被编码nsp3和报告基因的融合基因取代。其中，已有六种荧光报告蛋白(unag、mkate、mruby、tagbfp、cfp、yfp)分别被融合到nsp3 orf的c末端。在这些报告病毒中，报告基因通过t2a连接到nsp3的orf，t2a可实现对nsp3和报告基因的“终止-再启动”表达，因此，不影响nsp3和报告基因的功能。
4、2017年，kanai等人建立了猴sa11株的反向遗传学系统。此后各国实验室大多利用基于sa11株的反向遗传学技术开展的轮状病毒的各方面研究。随之，人类毒株ku、odelia、cdc-9、hn126，猴株rrv，禽株po-13和牛株rf的反向遗传学系统也相继被成功建立。2018年，komoto等人的实验室报道了仅转染表达基因组的11个t7拯救质粒可以更高效拯救病毒，前提是要将表达nsp2和nsp5的质粒提高3～5倍。2020年，美国实验室john t等人建立了“12质粒系统”，除了表达轮状病毒基因组的11个t7拯救质粒外，增加了非洲猪瘟病毒np868r加帽酶质粒。随后美国另一实验室liliana等人通过构建融合表达加帽酶和t7 rna聚合酶的辅助质粒，进一步优化了“12质粒系统”。遗憾的是国内关于轮状病毒反向遗传学的研究严重不足。同时，基于轮状病毒基因组的复杂性和对外来的同源基因节段的排斥性，我国还未见rv反向遗传学平台建立成功的报道。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用，搭建以llrv为骨架，实现轮状病毒遗传特征“定制式修订”或作为表达外源目的蛋白的载体的反向遗传学平台。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种羊轮状病毒重组质粒，所述重组质粒为pt7-vp1/llrv、pt7-vp2/llrv、pt7-vp3/llrv、pt7-vp4/llrv、pt7-vp6/llrv、pt7-vp7/llrv、pt7-nsp1/llrv、pt7-nsp2/llrv、pt7-nsp3/llrv、pt7-nsp4/llrv和pt7-nsp5/llrv；
4、所述pt7-vp1/llrv的序列如seq id no:108所示；所述pt7-vp2/llrv的序列如seqid no:109所示；所述pt7-vp3/llrv的序列如seq id no:110所示；所述pt7-vp4/llrv的序列如seq id no:111所示；所述pt7-vp6/llrv的序列如seq id no:112所示；所述pt7-vp7/llrv的序列如seq id no:113所示；所述pt7-nsp1/llrv的序列如seq id no:114所示；所述pt7-nsp2/llrv的序列如seq id no:115所示；所述pt7-nsp3/llrv的序列如seq id no:116所示；所述pt7-nsp4/llrv的序列如seq id no:117所示；所述pt7-nsp5/llrv的序列如seqid no:117所示；
5、可将所述重组质粒中的pt7-nsp1/llrv、pt7-nsp3/llrv、pt7-nsp4/llrv和pt7-nsp5/llrv用突变质粒进行替换；所述突变质粒为pt7-munsp1/llrv、pt7-munsp3/llrv、pt7-munsp4/llrv和pt7-munsp5/llrv，该突变用于区分与原轮状病毒的区别；
6、所述pt7-munsp1/llrv的序列是将所述pt7-nsp1/llrv的nsp1/llrv序列第1349和1363位分别由c和t突变为t和c；所述pt7-munsp3/llrv的序列是将所述pt7-nsp3/llrv的nsp3/llrv序列第799和811位分别由t和t突变为c和c；所述pt7-munsp4/llrv的序列是将所述pt7-nsp4/llrv的nsp4/llrv序列第395和404位分别由a和a突变为g和t；所述pt7-munsp5/llrv的序列是将所述pt7-nsp5/llrv的nsp5/llrv序列第298和306位分别由t和a突变为c和g。
7、本专利技术还提供了一种羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，包括所述的重组质粒、辅助质粒pcmv-868cp、ma104或ma104 n*v工程细胞株和bhk-t7/9细胞。
8、优选的，所述辅助质粒pcmv-868cp以cmv为启动子，以(g4s)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶np868r和t7 rnap。
9、优选的，所述ma104 n*v工程细胞株为基因组整合有bvdv的n蛋白和piv5的v蛋白的细胞株。
10、本专利技术还提供了一种所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统拯救病毒的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种羊轮状病毒重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pT7-VP1/LLRV、pT7-VP2/LLRV、pT7-VP3/LLRV、pT7-VP4/LLRV、pT7-VP6/LLRV、pT7-VP7/LLRV、pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP2/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV；
2.一种羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，包括权利要求1所述的重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP、MA104或MA104 N*V工程细胞株和BHK-T7/9细胞。
3.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述辅助质粒pCMV-868CP以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP。
4.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述MA104 N*V工程细胞株为基因组整合有BVDV的N蛋白和PIV5的V蛋白的MA104工程细胞株。
5.权利要求2～4任意一项所述
6.根据权利要求5所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统拯救病毒的方法，其特征在于，所述重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合比例为10～14μg：1～2μg：200～300μL；
7.权利要求1所述的羊轮状病毒重组质粒或权利要求2所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在构建表达外源蛋白的重组病毒或改造轮状病毒遗传特征中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述表达外源蛋白的基因片段连接到权利要求1所述的重组质粒上构建得到表达外源蛋白的重组病毒。
9.权利要求1所述的羊轮状病毒重组质粒或权利要求2所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在制备疫苗、药物和诊断试剂开发中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种羊轮状病毒重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pt7-vp1/llrv、pt7-vp2/llrv、pt7-vp3/llrv、pt7-vp4/llrv、pt7-vp6/llrv、pt7-vp7/llrv、pt7-nsp1/llrv、pt7-nsp2/llrv、pt7-nsp3/llrv、pt7-nsp4/llrv和pt7-nsp5/llrv；
2.一种羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，包括权利要求1所述的重组质粒、辅助质粒pcmv-868cp、ma104或ma104 n*v工程细胞株和bhk-t7/9细胞。
3.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述辅助质粒pcmv-868cp以cmv为启动子，以(g4s)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶np868r和t7 rnap。
4.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述ma104 n*v工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：达正茂，刘夏飞，
申请(专利权)人：伊诺维康北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。