【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有截短的v-结构域的细菌胶原样蛋白的分泌，具体地，涉及编码与seq id no：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列的多核苷酸，其中该核苷酸序列是编码胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列，并且其中该氨基酸序列包含在seq id no：1的氨基酸序列和相应多肽的n端处的至少38个氨基酸的缺失，以及涉及用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法。
技术介绍
1、细菌来源的胶原样蛋白(clp)(最工业相关的是酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的产物)具有相当令人感兴趣的机械特性，其类似于高等真核生物的胶原蛋白的机械特性，而不需要真核对应物所需的复杂成熟步骤。clp呈现共同的结构：彼此稳定的两个α螺旋构成“v结构域”，其后是杆状结构胶原结构域。在胶原结构域之后，在该蛋白的c端通常存在膜锚(gpi样)。
2、在几种系统中已经尝试了胶原样蛋白的表达，这些系统包括大肠杆菌(escherichia coli)和酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。本专利技术重点关注由scl2基因编码的酿脓链球菌clp在工业酵母巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)中的表达优化。
3、尽管在其它宿主(即大肠杆菌)中已经有可能实现scl2的表达(j.biol.chem.277,27312-27318)，并且甚至在细胞内表达后实现合理的效价(titer)(效价约为2g/l)，但在工业相关的酵母中的分泌生产(例如巴斯德毕赤酵母)从未实现，导致差的经济可行性方法。
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5、因此，本专利技术的目的是提供改进的生产clp的方法，该方法是成本有效的并且是适用的，而不需要添加用于切割所述结构域的特定蛋白酶。
6、本专利技术的公开内容提供解决方案以通过使用工业主力例如巴斯德毕赤酵母来实现更具成本效益的方法的。巴斯德毕赤酵母已被用作用于其它种类的胶原分子的宿主，通常是哺乳动物来源的胶原分子的宿主，如由werten及其同事最近报道的(biotechnologyadvances 37,issue 5,2019,pages 642-666)；然而，使用巴斯德毕赤酵母以用于clp生产还没有被描述。此外，这种酵母的使用出人意料地提供了从成熟蛋白中切割v结构域的解决方案。
7、为了理解v结构域的存在是否可能是分泌型表达为何如此低效的原因，使用最近公开的x-射线结构已经分析了这种结构域(j.biol.chem.289，5122-5133)，通过使用公开可获得的工具即jpred(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred)的手动评价来补充。已经可以鉴定v结构域的结构决定因素：该结构域先前已经在绝大多数科学出版物(proteinscience 2010,vol.19,pp775-785；j.biol.chem.,vol.280,no.19,pp.19343-19349，以及许多其它文献)中被报道为对胶原折叠而言是必不可少的，尽管v结构域的存在对蛋白表达的影响曾被讨论或提及。yu等人分析scl2细菌亚单位的不同片段(j.biol.chem.286,pp.18960-18968)在胶原稳定性中的竞争中的作用，将观测限制于结构性区域，但也生成缺乏v结构域的片段。此处未提及关于改善生产水平的报告：这并不出人意料，因为据认为，由于v结构域的截短而观测到的效果在分泌胶原时得以执行，这对于细菌胶原而言是迄今为止尚未描述的过程。
8、根据该假设，生成了一系列的截短：根本的逻辑是维持v结构域的通常被报道对于胶原折叠是必不可少的一部分，减少它的序列以最小化对细胞内的生产机制(machinery)的任何干扰，并因此能够在上清液中分泌显著量的蛋白。将这些构建体克隆并引入巴斯德毕赤酵母中后，出人意料地实现的是，当v结构域从原始完整序列截短时，clp的分泌得到了极大的改进。v结构域的部分去除允许显著地提高在巴斯德毕赤酵母中的蛋白产量；出人意料地，v结构域的完全去除不如这种结构域的部分截短那样有效。
9、本专利技术的结果可以在技术上应用于在胶原结构域中的scl2的任何修饰序列，因为它旨在作为促进序列(facilitated sequence)以促进在巴斯德毕赤酵母中的有效翻译或通过分泌机制的有效转运。
技术实现思路
1、本专利技术描述在甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母中生产细菌胶原样蛋白(clp)的新方法。相比于现有技术已知的当前方法，这种方法的关键特点是：1)蛋白被分泌在培养上清液中，允许在低成本培养基中达到高效价(＞5g/l)；2)蛋白容易从所述上清液中纯化，因为在培养基中不存在复杂组分。
2、出人意料地，来自分泌scl2p的巴斯德毕赤酵母培养的上清液的纯化产物显示出了出人意料的特性(profile)，其与成熟的胶原样序列相容。进一步的分析显示出了细胞内酶，最可能是加工蛋白酶kex2p，在不需要任何额外的蛋白酶步骤的情况下如何能够去除v结构域蛋白序列。此外，为了修饰存在于最终产物中的导致降解产物显著积累的切割位点，已对蛋白序列进行了突变，以对这种切割位点进行工程化改造并消除降解。出人意料地，当非极性氨基酸(缬氨酸，在野生型序列中)突变为极性氨基酸(谷氨酰胺)时，获得了最有效的性能。因此，所述方法：
3、1)与现有技术生产方法相比更具竞争性，允许在细胞外积累产物，因此允许避免任何细胞破坏以分离感兴趣的蛋白(protein of interest)；
4、2)出人意料地，不需要额外的用蛋白酶消化的步骤以去除主要产物的不需要的v结构域。这样的技术改进允许进一步改进方法的成本效益，允许直接在细胞培养物上清液中获得期望的产物。
5、3)所述方法(也)适用于携带v结构域截短的构建体。
6、4)所述方法还描述典型的发酵副产物，以及使最丰富的降解产物最小化的蛋白工程。
7、因此，本专利技术提供用于分泌细菌胶原样蛋白和相应的核苷酸序列以及多肽的新的发酵方法。
8、本专利技术涉及多核苷酸，其编码与seq id no：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包含在seq id no：1的氨基酸序列的n端处的至少38个氨基酸的缺失。
9、出人意料地发现，胶原样蛋白的截本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多核苷酸，其编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包括在SEQID NO：1的氨基酸序列的N端处的至少38个氨基酸的缺失。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列包含在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的N端处的38至90个氨基酸的缺失。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％、92％、94％、96％、9
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，其中核苷酸序列是编码来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的胶原样蛋白的可复制的核苷酸序列。
6.载体，其包含根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸。
7.多肽，其包含由根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸编码的氨基酸序列。
8.微生物，其包含根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸、或根据权利要求7所述的多肽、或根据权利要求6所述的载体。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中，所述微生物属于毕赤酵母属(Pichia)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、或棒杆菌属(Corynebacterium)，优选地是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
10.根据权利要求9所述的微生物，其中，根据权利要求1至5中的任意一项所述的多核苷酸以过表达的形式存在。
11.根据权利要求8至10中的任意一项所述的微生物，其特征在于，所述微生物具有分泌细菌胶原样蛋白的能力。
12.用于在宿主中分泌细菌胶原样蛋白的发酵方法，其包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法是选自分批法、补料分批法、重复补料分批法和连续法的方法。
14.根据权利要求8至11中的任意一项所述的微生物的用途，其用于细菌胶原样蛋白的发酵生产和分泌。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.多核苷酸，其编码与seq id no：1的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是编码胶原样蛋白的可复制的多核苷酸，并且其中所述氨基酸序列包括在seqid no：1的氨基酸序列的n端处的至少38个氨基酸的缺失。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列包含在seq id no：1的氨基酸序列的n端处的38至90个氨基酸的缺失。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列。
4.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸编码与seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9的氨基酸序列至少90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，优选地至少97％，特别优选地至少98％，非常特别优选地至少99％，极其优选地为100％相同的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的多核苷酸，其中核苷酸序列是编码来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的胶原样蛋白的可复制的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·卡马塔里，C·班格特，C·罗尔曼，C·林诺芬尔，
申请(专利权)人：赢创运营有限公司，
类型：发明
国别省市：
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