【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及自动提取细菌产生的目的质粒。
技术介绍
1、在细菌例如大肠杆菌中产生目的质粒是已知的，碱裂解后进行中和与沉淀步骤也是已知的(例如birnboim和dolly，1979，《核酸研究》，7，第1513-1523页)。
2、该方法实施简单，在批处理模式下效果良好；其适用于生产少量质粒，例如最多以克为数量级。
3、专利申请wo2010/136503(还公开于ep2435569b1、us8,822,672、us9,416,400等)描述了一种连续质粒提取方法，该方法基于用于不同溶液及其混合物的管道布置系统以及通过泵进行流量控制。除了通常由醋酸/醋酸盐缓冲液组成的中和溶液外，该方法还提供了浓缩的沉淀溶液的添加。通过调整管道内径，使中和溶液与沉淀溶液混合均匀，从而在局部产生文丘里效应。事实上，该专利申请的专利技术人指出，对于如此大量的粘性溶液，机械搅拌是不可能的。不同于通过文丘里效应进行的混合，机械搅拌存在剪切基因组dna甚至质粒的风险，这是不可接受的。此外，有利的是，该系统为一次性系统，因此不需要清洁。然而，尽管该系统对于纯化大量质粒(例如100克质粒)非常有效，但它会产生固定成本(一次性设备、质粒损失)，如果需要纯化的质粒数量较少，该固定成本就会变得很高。因此，存在一定范围的难以用分批法进行处理的量，也无法用上述连续法有效地处理，即使这两种方法在各自的应用中效果良好。
4、事实上，批处理模式下系统的效率受到物理参数的限制，例如容器的大小、使溶液接触所需的时间，甚至是快速均质化的需要。因此，
技术实现思路
1、本专利技术涉及一种提取由微生物合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：
2、获得与提取泵8相连的容器1，所述容器1设有机械搅拌装置9；
3、获得包含待提取质粒的所述微生物的细胞悬浮液2；
4、以预定流量(q1)向所述细胞悬浮液2中添加碱性裂解液3，以形成均质混合物；
5、以预定流量(q2)将所述均质混合物置于所述容器1中；
6、经过预定时间后，优选地在温和搅拌下，通过多个孔口7以预定流量(q3)向容器中添加包含醋酸的中和溶液5；
7、经过预定时间后，通过多个孔口7以预定流量(q4)向所述容器中添加沉淀溶液6；
8、在温和搅拌下经过预定时间后，通过所述提取泵8以预定流量(q5)提取由此形成的悬浮液，然后澄清提取的混合物，优选离心，以回收包含目的质粒的澄清上清液。
9、这种经提取和纯化的质粒可以有利地直接使用，也可以在灭菌过滤、超滤和/或精制层析后使用。
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1.一种提取由微生物合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液(2)和所述碱性裂解液(3)通过静态混合系统(4)在容器上游进行均质化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述碱性裂解液(3)的pH值为12.0至12.5，优选地，其中所述pH值由碱性氢氧化物固定。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述碱性裂解液(2)还包含洗涤剂，优选按重量计0.1％的十二烷基硫酸钠。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)的pH值为4.5至5.7。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)包含浓度大于1M的醋酸，优选地，其中所述中和溶液具有通过醋酸/醋酸盐混合物固定的pH值。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中溶液被中和至pH值小于7.0，优选小于6.0，且大于4.5，更优选小于6.0，且大于5.0。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述沉淀溶液(6)包含水溶性钙盐，浓度为3.5至6M，优选为约5
9.根据权利要求8所述的方法，其中在添加所述沉淀溶液后，溶液中的钙浓度为至少0.8M，优选至少1.0M，甚至更优选至少1.2M。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个孔口(7)为穿孔管道系统。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于添加所述中和溶液的所述多个孔口(7)和用于添加所述沉淀溶液的所述多个孔口(7)是相同的多个孔口(7)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)和/或所述沉淀溶液(6)基本上添加至所述容器(1)的底部，优选将按重量计至少50％的所述中和溶液和/或所述沉淀溶液添加至所述容器的底部的20％。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中流量Q1、Q2、Q3、Q4和Q5独立地为0.5升/分钟至25升/分钟，优选为1升/分钟至10升/分钟，甚至为2升/分钟至8升/分钟。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中温和搅拌产生的剪切应力不足以剪切来自宿主的质粒DNA或基因组DNA。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过蠕动泵添加和/或提取所述溶液。
16.根据前述权利要求中任一项从澄清上清液中纯化目的质粒的方法，其包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种提取由微生物合成的质粒的方法，其包括以下连续步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液(2)和所述碱性裂解液(3)通过静态混合系统(4)在容器上游进行均质化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述碱性裂解液(3)的ph值为12.0至12.5，优选地，其中所述ph值由碱性氢氧化物固定。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述碱性裂解液(2)还包含洗涤剂，优选按重量计0.1％的十二烷基硫酸钠。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)的ph值为4.5至5.7。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中和溶液(5)包含浓度大于1m的醋酸，优选地，其中所述中和溶液具有通过醋酸/醋酸盐混合物固定的ph值。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中溶液被中和至ph值小于7.0，优选小于6.0，且大于4.5，更优选小于6.0，且大于5.0。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述沉淀溶液(6)包含水溶性钙盐，浓度为3.5至6m，优选为约5m。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在添加所述沉淀溶液后...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·达肯特，P·莱登特，C·罗德里格兹，
申请(专利权)人：艾克斯普莱斯生物制药公司，
类型：发明
国别省市：
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