【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及制造周围神经样微组织的方法及其用途。
技术介绍
1、神经组织受到损伤后导致并发症，例如不可逆转的、永久性的运动、感觉和自主神经功能丧失。作为结果，神经损伤导致严重的社会、经济和医疗问题。就脊髓损伤(其是最常见的神经损伤之一)来说，在美国有约200000名患者，估计每年新发生病例约10000例。取决于严重程度，每名患者的治疗花费数十亿韩元，并且每年约2亿韩元，使得脊髓损伤成为经济和社会需求未得到高度满足的代表性的不治之症。调查表明，在韩国有约70000名永久性脊髓损伤患者。
2、神经损伤分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤由外部损伤的物理压迫造成的神经组织和血管中的损伤引起。继发性损伤由于原发性损伤之后的炎性反应、自由氧、自由基、缺血和缺氧、水肿和细胞死亡而发生。唯一的治疗包括在手术摘除受损组织、血肿和压迫神经组织的骨骼、以及脊柱固定、损伤后1天内服用高剂量的皮质类固醇。目前，不存在可以预防和减轻原发性损伤后的继发性损伤并使受损神经再生的治疗剂。
3、干细胞治疗剂是生物药物，其可应用于不能用传统治疗剂治疗的难治性疾病，例如神经损伤。干细胞治疗剂已经在减轻和抑制神经损伤后发生的继发性损伤方面显示出机制和有效性，并且已经发现干细胞治疗剂通过如下介导神经损伤后的再生效应：经由抗炎、免疫调节、抗自由基、细胞保护、血管生成和神经营养因子的分泌的间接机制，以及经由直接分化成神经元细胞或少突胶质细胞来促进轴突和髓鞘质的生长和生成的直接机制。
4、提出了如下机制，用于神经再生的干细胞治疗剂通过从移植
5、主要用作神经损伤治疗剂的干细胞是骨髓(bm)、脐带血(cb)和脐带(uc)、以及脂肪组织(at)源性的间充质干细胞(msc)，并且通过应用中枢神经系统源性的神经干细胞(nsc)、胚胎干细胞或诱导多能干细胞源性的nsc、或少突胶质祖细胞(opc)作为干细胞治疗剂来进行临床前或临床研究。皮肤或毛囊源性的祖细胞是存在于周围神经系统组织中的干细胞，具有分化为雪旺细胞、神经元细胞和间充质细胞的能力，具有与发育过程中暂时存在的神经嵴源性细胞相似的特征，并且用作神经损伤后再生治疗的细胞来源。然而，为了最大限度地发挥干细胞治疗剂的神经再生功能，需要能够增加神经营养因子的基因表达和蛋白质分泌的技术。
6、人工基因导入可增加干细胞神经营养基因的表达和蛋白质分泌，但人工操纵引起的安全性问题可能是临床应用的阻碍。然而，通过合并3d培养技术，可以通过为细胞提供3d环境来增加细胞固有的遗传功能。通过3d培养提供类似于体内的三维(3d)环境，使细胞与细胞以及细胞与细胞外基质(ecm)的相互作用成为可能，并作为结果，可以增加细胞中基因和蛋白质的表达和生成机制。多孔支撑物或水凝胶被广泛用于提供3d环境。在通过将细胞接种在这种生物材料中来构建3d结构的情况下，当将这种结构和细胞共同移植时，可能会出现许可问题(licensing issuea)，使得需要如下的技术，其允许细胞在没有支撑物或水凝胶帮助的情况下形成3d结构。
技术实现思路
1、技术问题
2、本公开的一个目的是提供制造周围神经样微组织的方法，其具有通过在悬浮培养环境中培养成体周围神经源性干细胞(pnsc)经由β-连环蛋白和整合素-β1形成的100-500个细胞的细胞与细胞和细胞与ecm的结合，同时由pnsc产生和分泌的周围神经特异性ecm积累在细胞基质中，并且能够通过分泌如下来诱导神经再生：选自于由bdnf、ngf、神经营养素-3和神经营养素-4所组成的组中的任何一种或多种神经营养家族因子，所述神经营养家族因子是由pnsc产生和分泌的神经营养因子；ephrin家族因子；选自于由gdnf和artemin所组成的组中的任何一种或多种gdnf家族因子；或选自于由il-6、cntf和lif所组成的组中的任何一种或多种cntf家族因子。
3、此外，本公开的另一个目的是提供周围神经样微组织，其是由100至500个pnsc结合的球形细胞结构，使所述pnsc在培养基中经受悬浮培养，所述培养基中包含人血清白蛋白(hsa)、地塞米松(dex)和n-乙酰半胱氨酸(nac)，直径为100±20μm，并且由pnsc的细胞与细胞的结合和pnsc与细胞外基质(ecm)的结合形成。
4、此外，本公开的另一个目的是提供一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物，包含周围神经样微组织作为活性成分。
5、此外，本公开的另一个目的是提供一种用于治疗神经炎症性疾病的药物组合物，包含周围神经样微组织作为活性成分。
6、技术方案
7、为了实现上述目的，本公开提供了一种制造周围神经样微组织的方法，包括：1)对周围神经源性干细胞(pnsc)进行单层培养；以及2)收集经单层培养的pnsc，以使其在包含人血清白蛋白(hsa)、地塞米松(dex)和n-乙酰半胱氨酸(nac)的培养基中经受悬浮培养。
8、此外，本公开提供了一种周围神经样微组织，其是由100至500个pnsc结合的球形细胞结构，使所述pnsc在包含hsa、dex和nac的培养基中经受悬浮培养，直径为100±20μm，并且由pnsc的细胞与细胞的结合和pnsc与细胞外基质(ecm)的结合形成。
9、此外，本公开提供了一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物，包含周围神经样微组织作为活性成分。
10、此外，本公开提供了一种用于治疗神经炎症性疾病的药物组合物，包含周围神经样微组织作为活性成分。
11、有益效果
12、本公开涉及制造周围神经样微组织的方法及其用途，并且特别涉及制造周围神经样微组织的方法，所述微组织由100至500个细胞组成，直径为100±20μm，通过分离和培养周围神经源性干细胞(pnsc)、然后使用分离和培养的pnsc通过悬浮培养形成细胞与细胞和细胞与细胞外基质的结合而获得。通过在悬浮培养环境中培养而制造的微组织具有以下结构特征，其中，100至500个细胞通过β-连环蛋白的细胞与细胞的结合而自组装，细胞间由pnsc产生和分泌的细胞外基质(ecm)积累，并且积累的ecm和细胞通过β1-整合素结合。组成细胞包括未成熟的周围神经源性干细胞、以及雪旺祖细胞、修复雪旺细胞、髓鞘形成雪旺细胞和间质基质细胞。这与损伤后再生的周围神经成分和组成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制造周围神经样微组织的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述悬浮培养中，每cm2面积的培养皿接种0.25×105至2.5×105个PNSC。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基包含0.01％至1％HSA、0.1μM至5μMDEX和0.1mM至10mM NAC。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述悬浮培养诱导所述PNSC的细胞与细胞的结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述周围神经样微组织是100至500个PNSC结合在一起的球形细胞结构，并且直径为100±20μm。
6.一种周围神经样微组织，所述周围神经样微组织是在包含HSA、DEX和NAC的培养基中经受悬浮培养的100至500个PNSC结合在一起的球形细胞结构，直径为100±20μm，并且通过PNSC的细胞与细胞的结合和PNSC与细胞外基质(ECM)的结合而形成。
7.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织具有细胞外基质，在所述细胞外基质中，由PNSC产生并分
8.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织包含周围神经源性的成体干细胞、雪旺祖细胞、修复雪旺细胞、髓鞘形成雪旺细胞和间充质间质基质细胞。
9.根据权利要求8所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织包含GFAP-/S100β-/Sox10+未分化神经嵴细胞、GFAP+/S100β+/髓鞘+髓鞘形成雪旺细胞、GFAP+/GAP43+/髓鞘-修复雪旺细胞和GFAP-/CD140a+间质基质细胞。
10.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织具有激活的Wnt/β-连环蛋白信号传导通路。
11.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织具有如下的增高的表达：选自于由BDNF、EFNA1、EFNA2、EFNA3、EFNA4、EFNA5、EFNB1、EFNB2、EFNB3、CTNF、GDNF、LIF、NGFB、NTF3、NTF5、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4和ZFP91所组成的组中的任何一种或多种神经营养因子；选自于由EGF、FGF1、FGF2、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF18、FGF19、FGF20、FGF23、IGF1和GAS6所组成的组中的任何一种或多种生长因子；选自于由CLC、CTF1、CSF1、CSF2、CSF3、GH1、GH2、FLT3LG、IDO1、IL2、IL3、IL5、IL7、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL15、IL20、IL21、IL22、IL23A、IL24、IL26、IL28A、IL29、IFNA1、IFNB1、IFNW1、IFNK、IFNE1、IFNG、KITLG、LEP、PRL、TGFB、TPO和TSLP所组成的组中的任何一种或多种免疫应答调节因子；或选自于由ANGPT1、ANGPT2、ANGPT4、EFNA1、EFNA2、EFNA3、EFNA4、EFNA5、EFNB3、EPO、PDGFC、PDGFD、VEGFA、VEGFB和VEGFC所组成的组中的任何一种或多种血管生成诱导因子。
12.一种用于治疗神经损伤疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求6至11中任一项所述的周围神经样微组织作为活性成分。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述药物组合物促进神经组织的再生。
14.一种用于治疗神经炎症性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求6至11中任一项所述的周围神经样微组织作为活性成分。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种制造周围神经样微组织的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述悬浮培养中，每cm2面积的培养皿接种0.25×105至2.5×105个pnsc。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基包含0.01％至1％hsa、0.1μm至5μmdex和0.1mm至10mm nac。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述悬浮培养诱导所述pnsc的细胞与细胞的结合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述周围神经样微组织是100至500个pnsc结合在一起的球形细胞结构，并且直径为100±20μm。
6.一种周围神经样微组织，所述周围神经样微组织是在包含hsa、dex和nac的培养基中经受悬浮培养的100至500个pnsc结合在一起的球形细胞结构，直径为100±20μm，并且通过pnsc的细胞与细胞的结合和pnsc与细胞外基质(ecm)的结合而形成。
7.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织具有细胞外基质，在所述细胞外基质中，由pnsc产生并分泌的vi型胶原蛋白和层粘连蛋白在细胞间隙中积累，并且细胞通过cd29与细胞外基质结合，且细胞通过β-连环蛋白与细胞结合。
8.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织包含周围神经源性的成体干细胞、雪旺祖细胞、修复雪旺细胞、髓鞘形成雪旺细胞和间充质间质基质细胞。
9.根据权利要求8所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织包含gfap-/s100β-/sox10+未分化神经嵴细胞、gfap+/s100β+/髓鞘+髓鞘形成雪旺细胞、gfap+/gap43+/髓鞘-修复雪旺细胞和gfap-/cd140a+间质基质细胞。
10.根据权利要求6所述的周围神经样微组织，其中，所述周围神经样微组织具有激活的wnt/β-连环蛋白信号传导通路。...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨英一，李源晋，廉正恩，
申请(专利权)人：韩创干细胞生物科技公司，
类型：发明
国别省市：
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