【技术实现步骤摘要】
本申请属于干细胞检测领域，具体涉及一种间充质干细胞成软骨分化定量检测方法。
技术介绍
1、番红o(也叫做番红或基本红2或藏红t)是组织和细胞生物学实验中常用的染料。番红o在染色的实验中用作复染剂，可将所有的细胞核染成红色；还可以被用来检测软骨、黏蛋白和肥大细胞。间充质干细胞具有软骨分化能力，在体外经过诱导后可分化为软骨细胞，可用番红o进行染色鉴定。但番红o染色只能对分化能力进行定性检测，缺少对成软骨分化定量检测的方法和手段。
2、间充质干细胞分化后用番红o对软骨细胞染色，需要洗脱与细胞结合的番红o染料，进而对软骨细胞吸附的染料进行定量分析；所以脱色液以及脱色方法的选择往往会影响实验结果。
3、乙醇和异丙醇是有机原料和溶剂，常用于对番红o进行脱色，但是其对于进入细胞内染料脱色效果不佳；且两者的易挥发，使其脱色能力进一步受到限制。为解决上述问题，寻求合适的脱色液和方法具有重要意义。
技术实现思路
1、为解决现有技术中乙醇和异丙醇对细胞内番红o脱色效果不佳、易挥发的缺点，本专利技术开发一种可在短时间内达到理想脱色效果且易于操作的脱色方法。在此基础上，采用合适的脱色液进行脱色后的吸光度检测，建立了间充质干细胞成软骨分化的定量检测方法。
2、一种间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
3、(1)将间充质干细胞成软骨诱导分化体系固定后，用番红o染色液进行染色，完成染色后，弃去番红o染色液，将番红o染色后的成软骨诱导分化体系纯水
4、(2)使用cpc脱色液对步骤(1)纯水洗涤后的成软骨诱导分化体系进行脱色处理，脱色结束后，取cpc脱色液，在540nm下测定cpc脱色液吸光度od值，根据od值对成软骨分化进行相对定量检测分析。
5、本专利技术定量检测方法基于番红o能够结合软骨细胞，采用番红o对间充质干细胞成软骨诱导分化体系染色，从而结合间充质干细胞成软骨诱导分化体系中已分化的软骨细胞，进而采用cpc脱色液将与细胞结合的番红o染料洗脱出来，使用酶标仪540nm处定量检测cpc脱色液(此时已是cpc脱色液和番红o染料的混合溶液)的od值。通过od值的大小来判断细胞软骨分化程度，细胞分化程度越高，结合番红o就越多，所检测的od值就越大，由此完成相对定量检测。
6、进一步的，步骤(1)所述固定为去除间充质干细胞成软骨诱导分化体系中的诱导分化培养液后，磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，4％多聚甲醛固定。
7、进一步的，步骤(1)所述番红o染色液的浓度为0.05％。
8、进一步的，步骤(1)中纯水洗涤后，将染色后的间充质干细胞成软骨诱导分化体系显微镜观察，确定染色完全。
9、进一步的，步骤(2)所述cpc脱色液的配制方法为：向ph为6.5～7.5的磷酸钠缓冲液中加入cpc粉末，配制成浓度为8％～10％的cpc溶液。
10、优选的，配制成浓度为10％的cpc溶液。
11、进一步的，所述磷酸钠缓冲液的配制方法为：取固体磷酸钠，与纯水混匀，得到磷酸钠溶液，所述固体磷酸钠在纯水中的浓度为9mm～11mm；加入柠檬酸，调整磷酸钠缓冲液的ph至6.5～7.5。
12、优选的，所述固体磷酸钠在纯水中的浓度为10mm。
13、进一步的，步骤(2)中cpc脱色液加入量为至少完全覆盖成软骨诱导分化体系。
14、本专利技术脱色处理时间为将成软骨诱导分化体系中的番红o充分洗脱，在某个特殊的实施例中，步骤(2)中脱色处理时间不少于1h；例如，脱色处理时间为1h、2h、不少于12h～16h的过夜脱色处理。
15、进一步的，步骤(2)所述根据od值对成软骨分化进行定量检测具体为：对脱色后的cpc脱色液在540nm处检测，根据od值大小进行分化程度判断，od值越大，表明软骨细胞分化程度越高。
16、在本专利技术图像采集过程的作用在于确定番红o染色情况和cpc脱色效果，并非本专利技术的必须操作。在图像采集过程中可以加入少量水以防干燥。
17、本专利技术成软骨诱导分化体系类型包括：
18、1)间充质干细胞贴壁后向成软骨方向诱导分化的成软骨诱导分化体系；
19、2)直接诱导间充质干细胞向成软骨方向诱导分化的成软骨诱导分化体系(初期为细胞沉淀-在离心管等容器中培养，间充质干细胞并不会贴壁，经诱导后会形成软骨小球，悬浮于成软骨分化培养液中)。
20、这两种细胞状态均可以使用此检测定量方法。
21、本专利技术所阐述的脱色方法相较于异丙醇脱色具有以下优点：
22、1)脱色时间可灵活：cpc脱色液过夜放置，无明显挥发，实验人员可根据实际情况安排实验；而异丙醇有刺鼻气味且易挥发，脱色时间受到限制。
23、2)脱色效率高：可在较短时间(如脱色1h)洗脱细胞内吸附的番红o染料；而异丙醇对于细胞内吸附的染料脱色效果不佳。
24、3)结果可定量：所检测的od值能直观反映细胞结合番红o的能力，进而对间充质干细胞的成软骨分化能力进行定量检测。
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1.一种间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述固定为去除间充质干细胞成软骨诱导分化体系中的诱导分化培养液后，PBS洗涤，4％多聚甲醛固定。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述番红O染色液的浓度为0.05％。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中纯水洗涤后，将染色后的间充质干细胞成软骨诱导分化体系显微镜观察，确定染色完全。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述CPC脱色液的配制方法为：向pH为6.5～7.5的磷酸钠缓冲液中加入CPC粉末，配制成浓度为8％～10％的CPC溶液。
6.根据权利要求5所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，所述磷酸钠缓冲液的配制方法为：取固体磷酸钠，与纯水混匀，得到磷酸钠溶液，所述固体磷酸钠在纯水中的浓度为9mM～1
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中CPC脱色液加入量为至少完全覆盖成软骨诱导分化体系。
8.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中脱色处理时间为将成软骨诱导分化体系中的番红O充分洗脱。
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述固定为去除间充质干细胞成软骨诱导分化体系中的诱导分化培养液后，pbs洗涤，4％多聚甲醛固定。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述番红o染色液的浓度为0.05％。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中纯水洗涤后，将染色后的间充质干细胞成软骨诱导分化体系显微镜观察，确定染色完全。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞成软骨分化定量检测方法，其特征在于，步骤(2)所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王智辉，黄彤舸，廉云飞，陆晓，马进，刘梦丽，姚惠，庄敏艳，
申请(专利权)人：江苏拓弘康恒医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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