一种低毒、高效的细胞治疗用载体的制造方法技术

本发明专利技术提供一种低毒、高效的细胞治疗用载体的制造方法，具体涉及提供DMTMM在制备药物递送脂质体中的应用，一种药物递送脂质体的制备方法，前述的制备方法制备得到的药物递送脂质体，前述的药物递送脂质体在制备核酸药物中的应用。本发明专利技术提供的制备方法制备得到的脂质体毒性低且与生物分子偶联的获取率高。本方法安全性高、获得量大、工艺难度低，适于推广应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种低毒、高效的细胞治疗用载体的制造方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种低毒、高效的细胞治疗用载体及其制造方法和应用。

技术介绍

[0002]基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。目前利用“表达某种基因”、“表达某种蛋白”进行治疗主要通过质粒DNA、mRNA的导入来实现，利用“抑制某种基因”进行治疗则主要通过siRNA或微小RNA来实现。基于siRNA、mRNA的基因治疗手段具有其他类型核酸药物所没有的独特优势，然而mRNA和siRNA开发的共同难点就是如何将其有效地递送到靶部位的细胞中去。
[0003]脂质体以其灵活的物理化学和生物物理性质，作为一种重要的潜在的关键药物输送系统而继续被研究。脂质体偶联药物分子数量是治疗的关键，增加脂质体偶联药物分子数量，进而提高药物分子的表达量，从而达到提高治疗的效果的目的。
[0004]通过脂质体载药的基因治疗在细胞治疗中是非常重要的，而它的安全性高，毒性低是最重要的。同时还需要其获得率高，制备容易。
[0005]目前作为基因治疗用递送系统(如脂质体、LNP等)的生产方式缺点明显，导致相关基因治疗的安全性风险大，传统方法包括两种(一步法、两步法)，其不足如下：
[0006]1)以碳二亚胺(EDC)为交联剂的一步法，原理是首先与羧基反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。
[0007]2)以碳二亚胺(EDC)与N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)为交联剂的两步法。原理是首先与羧基反应，然后与NHS反应形成中间产物，中间产物与氨基反应，然后脱去中间产物，实现羧基与氨基的偶联。
[0008]上述两种方法对pH要求较高，偶联效率较低，值得一提的是，传统方法所使用的反应溶剂(醇类、醛类、环氧类)等具有较大的生物毒性，残留基团多且杂，对产品带来较大风险，废弃物处理给企业、环境带来较大的压力。在临床上往往伴随着不良的副作用，用这种方法制备的脂质体，能实现更加的安全及低毒性。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种低毒性的脂质体与生物分子偶联的高获取率的方法。本方法安全性高、获得量大、工艺难度低，适于推广应用。
[0010]为达到上述目的，本方法所采用的技术方案如下：
[0011]本专利技术的第一个目的是提供DMTMM在制备药物递送脂质体中的应用。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种药物递送脂质体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0013](1)DMTMM溶液配制：取DMTMM(4
‑
(4,6
‑
二甲氧基三嗪
‑2‑
基)
‑4‑
甲基吗啉盐酸盐)
溶解于去离子水中，配置成1
‑
2M的DMTMM溶液；
[0014](2)脂质体的制备：取氯化三甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基铵(DOTMA)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)混合制备脂质体；
[0015](3)十二烷基硫酸钠溶液配制：取十二烷基硫酸钠溶解于去离子水中，配置成0.1
‑
0.5％的溶液；
[0016](4)NH2‑
PEG
‑
N3溶液配制：取NH2‑
PEG
‑
N3(叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨)溶解于去离子水中，配置成0.1
‑
1M的溶液。
[0017](5)脂质体与叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基结合：将步骤(2)制备的脂质体与与步骤(3)配制的十二烷基硫酸钠溶液混合后，与步骤(4)制备的叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基在步骤(1)配制的DMTMM溶液的作用下结合生成所述药物递送脂质体。
[0018]进一步的，步骤(2)所述氯化三甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:1
‑
1：3。
[0019]进一步的，步骤(4)中所述叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基中聚乙二醇的聚合度为10～23。
[0020]进一步的，步骤(5)中所述步骤(2)制备的脂质体与叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基的摩尔比为1：1
‑
1：3。
[0021]进一步的，步骤(5)中所述步骤(2)制备的脂质体与步骤(1)配制的DMTMM溶液的体积比为1：1
‑
1：5。
[0022]进一步的，步骤(5)中脂质体与十二烷基硫酸钠溶液的体积比为1：1。
[0023]进一步的，步骤(2)及步骤(5)中的混合操着均为过夜搅拌混合。
[0024]本专利技术的第三个目的是提供采用前述的制备方法制备得到的药物递送脂质体。
[0025]本专利技术的第四个目的是提供前述的药物递送脂质体在制备核酸药物中的应用。
[0026]进一步的，将所述药物递送脂质体搭载核酸。
[0027]有益效果
[0028]DMTMM作为酰胺化，酯化，苷化和磷酸化反应中的高效缩合剂使用。相对于一些常有缩合剂，这种DMTMM具有更高的选择性。在DMTMM参与的反应，可以以水或者醇作为反应溶剂；相对于羟基，DMTMM对羧基选择性非常高。
[0029]采用DMTMM作为高效交联剂，相比于传统的EDC/NHS体系活性更高，可接受水或醇类作为反应溶剂，对pH要求低，偶联效率高，残留基团少，生物惰性(毒性小、抑制细胞粘附与免疫反应)。DMTMM作为高效交联剂，在大规模生产中的应用场景少，传统制造企业的保守策略导致相关技术在商业化中的研发投入少。本专利技术提供一套成熟、可行的高效、低毒性的基因治疗药物的生产方法。
附图说明
[0030]图1细胞转染前后细胞对比；
[0031]图2细胞转染后收获细胞活率对比；
[0032]图3对照组与转染组蛋白A表达量对比图；
[0033]图4不同添加物培养细胞图片；
[0034]图5不同添加物培养细胞收获活率；
[0035]图6不同溶剂下不同偶联剂偶联成功的收获率。
具体实施方式
[0036]实施例1药物递送脂质体的制备及转染
[0037](1)DMTMM试剂配制：用电子天平称取3g的DMTMM加入50ml的离心管内，加入8ml的去离子水溶解，最后用去离子水定容至10ml，所述DMTMM溶液的摩尔浓度为1.09M。
[0038](2)脂质体的制备：DOTMA(氯化三甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基铵)与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)按摩尔比1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.DMTMM在制备药物递送脂质体中的应用。2.一种药物递送脂质体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)DMTMM溶液配制：取DMTMM溶解于去离子水中，配置成1
‑
2M的DMTMM溶液；(2)脂质体的制备：取氯化三甲基
‑
2,3
‑
二油烯氧基丙基铵与二油酰基磷脂酰乙醇胺混合制备脂质体；(3)十二烷基硫酸钠溶液配制：取十二烷基硫酸钠溶解于去离子水中，配置成0.1
‑
0.5％的溶液；(4)叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨(NH2
‑
PEG
‑
N3)溶液配制：取NH2
‑
PEG
‑
N3溶解于去离子水中，配置成0.1
‑
1M的溶液。(5)脂质体与叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基结合：将步骤(2)制备的脂质体与步骤(3)配制的十二烷基硫酸钠溶液混合后，与步骤(4)制备的叠氮
‑
聚乙二醇
‑
氨基在步骤(1)配制的DMTMM溶液的作用下结合生成所述药物递送脂质体。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦静，陆晓，
申请(专利权)人：江苏拓弘康恒医药有限公司，
类型：发明
国别省市：