【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体地，涉及一种利用氨基酸调控酵母产类胡萝卜素比例的方法。
技术介绍
1、类胡萝卜素作为有益的有机色素，天然存在于光合生物体内。同时，这些物质也常被发现存在于某些非光合生物中，它们主要起保护细胞免受光和氧气损坏的作用。作为一种重要的脂溶性色素，具有多种生物活性和化学特性，表现出强抗氧化能力、抗肿瘤和抗微生物特性，在食品、饲料、化妆品等领域被广泛应用。微生物是生产天然类胡萝卜素一大来源，但自然界微生物生产类胡萝卜素具有产量低、培养条件复杂、生产不稳定，类胡萝卜素产品单一等缺点。因此，采用工程菌，将植物、微生物等天然产类胡萝卜素基因进行克隆，优化组装，构建工程菌生产类胡萝卜素具有较大应用前景，同时可通过外源添加营养成分，调控细胞生产不同比例的类胡萝卜素。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供了一种利用氨基酸调控酵母产类胡萝卜素比例的方法。
2、氨基酸是微生物代谢调控的重要营养成分，氨基酸在微生物体内，既可以提供碳源，也能提供氮源。同时，氨基酸也是微生物参与合成代谢的重要前体物质，不同微生物对氨基酸喜好程度不一。氨基酸作为次级代谢产物生产调控一重要手段，很早被使用于抗生物领域的发酵调控。工业发酵所使用的有机氮源，往往存在氨基酸组成差异，对细菌、酵母、真菌发酵都有重要影响。
3、采用合成生物学手段改造酿酒酵母产类胡萝卜素，通过工艺优化最高产量达到1.6g/l，使用不同蛋白胨作为有机氮源发酵，类胡萝卜素比例存在差异。对比分析几种蛋白胨，主要
4、本专利技术意外发现，采用外源添加至少包括如下5种氨基酸，可以有效的提高酵母产类胡萝卜素的含量。即本专利技术提供的利用氨基酸调控酵母产类胡萝卜素比例的方法包括如下步骤：在发酵培养基中加入氨基酸；该氨基酸(也可称为氨基酸组合物)包括半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸。其中，半胱氨酸的含量至少为0.8g/l，缬氨酸的含量至少为0.5g/l，丙氨酸的含量至少为1.0g/l，丝氨酸的含量至少为0.6g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7g/l。
5、在本专利技术的一个优选实施方式中，在该氨基酸(也可称为氨基酸组合物)中，半胱氨酸的含量为0.8-3.0g/l，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/l，丙氨酸的含量为1.0-3.5g/l，丝氨酸的含量至少为0.6-3.0g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7-3.0g/l。进一步优选的是，在该氨基酸(也可称为氨基酸组合物，以下不再一一赘述)中，所述半胱氨酸的含量为1.8-3.0g/l，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/l，丙氨酸的含量为1.0-2.0g/l，丝氨酸的含量至少为1.2-3.0g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7-2.0g/l。
6、申请人发现，可以将上述氨基酸在酵母发酵培养的任意时期按照比例加入发酵培养基中以实现调控目的。例如，可以将上述氨基酸单独在初始的发酵培养基中加入，也可以单独在发酵过程中加入补料的时候和补料一起加入发酵体系中，也可以同时在上述两个发酵时期均加入(每个时期的加入量可以根据实际需要选择，例如说，可以在一个时期先加入50％，或60％，或70％，或80％，或90％的氨基酸，然后在另一个时期加入剩下的氨基酸)，只需要保证加入培养基中的氨基酸中各组分的总浓度在上述浓度范围内(上述浓度指的是在发酵培养基中的浓度)即可。在本专利技术优选实施方式中，在发酵过程中将上述氨基酸与补料一起加入可以使上述氨基酸更好的发挥调控作用。进一步优选的是，将上述氨基酸在酵母菌种生长阶段和/或产物合成阶段与补料一起流加至发酵体系中。可选的是，将氨基酸的组合物配置成浓缩液，在生长阶段流加加入一半的浓缩液，然后在产物合成阶段流加补入剩下的浓缩液。
7、在本专利技术的具体实施方案中，酵母即为酵母菌株，酵母菌株可以为能产类胡萝卜素的酿酒酵母菌株，例如可以为酿酒酵母菌株。在本专利技术的具体实施方式中，以已经公开的cn110195023b涉及的菌株为例说明本专利技术目的和效果。具体为保藏编号为cgmcc no.17913的酿酒酵母菌株，该菌株公开于专利cn110195023b。
8、在本专利技术的方案中，将酵母菌株进行发酵培养，可以选用任意的发酵培养基进行培养，只需要满足酵母菌株成长的需求即可，发酵培养基的种类并不影响本专利技术的核心专利技术点所带来的效果。在本专利技术的具体实施方式中，酵母初始的发酵培养基中，含氮量(以总氮计)可以为2.5-5g/l，含碳量(以总碳计)可以为10-20g/l。
9、在本专利技术的具体实施方式中，发酵培养基中的碳源可以为葡萄糖，氮源可以为酵母浸膏、酵母粉和/或蛋白胨。在摇瓶发酵中，可以使用包括20g/l碳源(其中，碳源可以为葡萄糖)、10g/l常规天然氮源(氮源可以为酵母浸膏)和2g/l的磷酸氢二钾的初始的发酵培养基中加入不同的氨基酸组合物来详述本专利技术。
10、在本专利技术的方案中，发酵培养基的培养条件为本领域中常规的条件，可以为发酵温度为30℃。发酵40h后，细胞生长进入停滞期，将发酵温度控制在20℃，同时加入d-半乳糖诱导，诱导结束后进入产物合成阶段。每隔12h补入终浓度10g/l乙醇作为产物积累骨架，连续发酵到96h，收集发酵液，进行样品处理，检测类胡萝卜素组成及产量。在本专利技术中的具体实施方式中，摇瓶发酵主要为效果的初步探究。在具体的实施方式中，摇瓶发酵时间可以为96h。若是使用发酵罐进行正式发酵，发酵时间可以为160-225小时。
11、在本专利技术一个可选实施方式中，在菌体生长阶段，发酵培养基中的氮源含量低于1g/l时，可以向发酵培养基中补入氮源，补入氮源的量为1.5-4g/l(以总氮量计)。氮源可以使用本领域中常用的方式加入，例如说通过流加的方式加入，也可以一次性加入，只要补入的总量在该范围即可。
12、在本专利技术一个优选实施方式中，在发酵过程中的产物合成阶段，补入氮源的量为1.5-3g/l(以总氮量计)。
13、同时，本专利技术的申请人发现：天然氮源对于发酵产物中各物质的比例影响较大，另外，即使是同样采用酵母粉氮源，不同批次的发酵结果显示含量存在较大的差异，之前参考cn110195023b优化后的方案用酵母粉的多次实验中，虽然产生了理想的结果但仍然有部分偏差结果。例如：在同样的实验方案中，3批次实验，得到的结果分别是：0.378g/l虾青素和0.189g/l番茄红素；0.208g/l虾青素和0.035g/l番茄红素；0.393g/l虾青素和0.096g/l番茄红素。从这三组平行实验的结果来看，工艺的稳定性并不高。而在本专利技术的方案中，当补料氮源包括氨基酸时可以使得结果更加稳定。
14、本专利技术在发酵过程中添加特定的氨基酸组合(半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸)可以显著的提高酿酒酵母产类胡萝卜素的含量，适当提高了类胡萝卜的产量，同时还具有稳定工艺的特点，相比再次通过基因工程调控，具有简单、高效、成本低的优点。...
【技术保护点】
1.一种利用氨基酸调控酵母产类胡萝卜素比例的方法，其特征在于，包括如下步骤：在发酵培养基中加入氨基酸；所述氨基酸包括半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸；其中，半胱氨酸的含量至少为0.8g/L，缬氨酸的含量至少为0.5g/L，丙氨酸的含量至少为1.0g/L，丝氨酸的含量至少为0.6g/L，苯丙氨酸的含量至少为0.7g/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸的含量为0.8-3.0g/L，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/L，丙氨酸的含量为1.0-3.5g/L，丝氨酸的含量至少为0.6-3.0g/L，苯丙氨酸的含量至少为0.7-3.0g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸的含量为1.8-3.0g/L，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/L，丙氨酸的含量为1.0-2.0g/L，丝氨酸的含量至少为1.2-3.0g/L，苯丙氨酸的含量至少为0.7-2.0g/L。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸在初始的发酵培养基中加入和/或在发酵过程中与补料一起加入。
5.根据权
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述初始的发酵培养基中氮含量为2.5-5g/L，碳含量为10-20g/L。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在菌体生长阶段，发酵培养基中的氮源含量低于1g/L时，向发酵培养基中补入氮源，以总氮量计，补入氮源的量为1.5-4g/L。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在产物合成阶段，以总氮量计，补入氮源的量为1.5-3g/L。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述补料氮源包括酵母浸膏。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酵母浸膏和氨基酸一起作为补料氮源加入。
...【技术特征摘要】
1.一种利用氨基酸调控酵母产类胡萝卜素比例的方法，其特征在于，包括如下步骤：在发酵培养基中加入氨基酸；所述氨基酸包括半胱氨酸、缬氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸；其中，半胱氨酸的含量至少为0.8g/l，缬氨酸的含量至少为0.5g/l，丙氨酸的含量至少为1.0g/l，丝氨酸的含量至少为0.6g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸的含量为0.8-3.0g/l，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/l，丙氨酸的含量为1.0-3.5g/l，丝氨酸的含量至少为0.6-3.0g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7-3.0g/l。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸的含量为1.8-3.0g/l，缬氨酸的含量为0.5-1.2g/l，丙氨酸的含量为1.0-2.0g/l，丝氨酸的含量至少为1.2-3.0g/l，苯丙氨酸的含量至少为0.7-2.0g/l。
4.根据权利要求1至3...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪志明，余超，邬旻，李翔宇，
申请(专利权)人：嘉必优生物技术武汉股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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