【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于固定化脂肪酶制备，具体涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法与在pickering界面催化中的应用。
技术介绍
1、脂肪酶(lipase，ec 3.1.1.3)具有特异性催化酯水解、酯合成和酯交换反应的活性，其反应条件温和、工艺简单、产物纯度高，在食品、化工、医药及生物能源等方面中有着广泛用途。但在加工中使用游离脂肪酶有许多限制，比如游离酶稳定性低，在催化结束后回收困难等。并且由于脂质底物不溶于水，脂肪酶只能在油水两相的界面上催化反应，使催化效率受到界面面积和传质的制约。固定化脂肪酶技术可以改善上述缺点，并且能够带来如磁响应、ph响应、光响应等额外的优良特性。在非连续型反应系统中，固定后的脂肪酶可以很容易的从溶液中分离出来，其催化活性损失较低，这使其具有令人满意的重复使用性。
2、固定化脂肪酶载体材料主要为包括sio2、tio2、海藻酸钙、纤维素和变性淀粉在内的多种无机、有机多孔颗粒、中空微球和janus粒子等。这些粒子经疏水改性后可用于构建pickering乳液，并为底物和脂肪酶提供稳定的乳液反应体系。由于这些粒子避免了乳化剂的使用，减少了脂肪酶的活性损失和乳化剂带来的不利因素，使得它们在化工领域得到广泛应用。研究表明，这些粒子本身或改性剂都存在一定的毒性，这限制了其在食品、日用品工业中的应用。固定化脂肪酶技术中经常需要使用交联剂(如戊二醛、己二胺和双重氮联苯胺等)，这些物质会导致酶的活性降低，并带来一定的毒性。
3、天然绿色材料来源广泛，资源丰富，并且具有较高的生物安全性，使用其构建的固定化脂
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的首要目的在于提供一种固定化脂肪酶的制备方法，该制备方法以京尼平水溶液、戊二醛水溶液或香草醛水溶液作为交联剂，以虫胶纳米颗粒(snps)和壳聚糖分别制备乳液，再将含交联剂和被交联物质的乳滴融合，实现脂肪酶的固定化和载酶颗粒的疏水改性。该载酶颗粒的特征在于外层由虫胶纳米颗粒覆盖，内部为交联脂肪酶的壳聚糖微凝胶。
2、本专利技术的第二目的在于提供一种固定化脂肪酶。通过实验发现，本专利技术制备的固定化脂肪酶(snps-cs@lipase)的酶活为10.53±0.48u/mg，高于空颗粒+脂肪酶的3.71±0.50u/mg和游离脂肪酶的0.92±0.02u/mg。在循环使用10次后，snps-cs@lipase的酶活仍能存留86.52±3.09％，表明其复用性良好。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种固定化脂肪酶在pickering界面催化中的应用。本专利技术为使用天然绿色材料构建更具安全性的固定化脂肪酶提供了一条可行途径，有助于固定化脂肪酶在食品、日用品工业中的应用。
4、本专利技术的首要目的通过以下技术方案实现，
5、一种固定化脂肪酶的制备方法，包括如下步骤：
6、(1)将虫胶纳米颗粒水分散液与交联剂溶液混合，配制混合液ⅰ，再将混合液ⅰ加入含司盘80的液体石蜡中，高速剪切均质，获得含交联剂的不稳定乳液a；
7、(2)将念珠菌属脂肪酶(lipase from candida sp.)酶液与酸性壳聚糖溶液混合，配制混合液ⅱ，将混合液ⅱ加入含司盘80的液体石蜡中，高速剪切均质，获得含被交联物质的不稳定乳液b；
8、(3)将步骤(1)获得的乳液a与步骤(2)获得的乳液b混合并培育，进行乳滴的融合交联和失水收缩，即得固定化脂肪酶(snps-cs@lipase)。
9、优选地，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液和京尼平水溶液的体积比为(4-6):1；所述虫胶纳米颗粒分散液质量浓度为0-2wt.％，其中虫胶纳米颗粒直径为100-200nm；所述交联剂为质量浓度为5-15mg/ml京尼平水溶液，体积浓度为2-10％v/v的戊二醛水溶液或质量浓度为1-8mg/ml香草醛水溶液中的一种。
10、优选地，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液的具体制备方法如下：
11、(a)将1.2g虫胶溶解在80ml的无水乙醇中，获得15mg/ml虫胶乙醇溶液，将虫胶乙醇溶液通过0.22μm的过滤器以除去少量的不溶物；
12、(b)使用0.43mm直径的不锈钢针以0.45ml/min的速率将过滤后的虫胶乙醇溶液滴入100ml蒸馏水中，为了确保几乎所有的虫胶都转化为snps，用磁力搅拌器以600rpm的速度搅拌蒸馏水，直到虫胶乙醇溶液滴完为止；
13、(c)使用滤纸过滤除去少量未形成纳米颗粒的虫胶聚集体以获得原始snps分散液，并使用旋转蒸发仪除去原始分散液中的所有乙醇，最后向蒸发后的分散液中加入蒸馏水调节分散液的总体积为100ml。
14、优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述含司盘80的液体石蜡的浓度为0.04-0.08g/ml，水相和液体石蜡相比为1:(1-3)，高速剪切均质条件为转速10000-14000rpm，时间1-3min。
15、优选地，步骤(2)中所述念珠菌属脂肪酶酶液与酸性壳聚糖溶液的体积比为1:(1-3)，其中脂肪酶酶液的脂肪酶浓度为0.05-0.2g/ml，脂肪酶酶液用磷酸根浓度为5-15mm，ph为7.0-8.0的磷酸缓冲液预先稀释4-6倍，酸性壳聚糖溶液中的壳聚糖浓度为1-3wt.％，乙酸体积浓度为0.4-0.8％。
16、优选地，步骤(3)中所述乳液a和乳液b的体积比为(0.8-1.2):1；所述融合交联和失水收缩的条件为：开放式恒温水浴搅拌，温度为30-45℃，转速为500-1500rpm，时间为40-60h。
17、本专利技术的第二目的通过以下技术方案实现：
18、一种由上述方法制备得到的固定化脂肪酶。
19、本专利技术的第三目的通过以下技术方案实现：
20、一种固定化脂肪酶在pickering界面催化中的应用，所述应用具体包括：将酸醇溶液与去离子水混合，加入固定化脂肪酶，恒温搅拌进行反应。
21、优选地，所述酸醇溶液为己酸和己醇的正己烷溶液，己酸和己醇在正己烷溶液中的浓度为0.3-0.5mol/l；所述酸醇溶液和去离子水比为1-2:1；所述固定化脂肪酶的在反应体系中的质量浓度为20-50mg/ml。
22、优选地，所述恒温搅拌条件：温度为35-45℃，转速为300rpm，反应时间为10-14h。
23、本专利技术的技术方案相比现有技术具有以下优点：
24、(1)本专利技术所述固定化脂肪酶完全使用天然绿色材料构建，避免了由固定化材料带来毒性和在食品、日用品工业中应用的不安全隐患。
25、(2)在所制备的固定化脂肪酶中，酶与壳聚糖形成的微凝胶通过共价键连接，并且微凝胶被虫胶纳米颗粒所覆盖，有效提高的脂肪酶的复用性，减少了脂肪酶催化活性本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液和京尼平水溶液的体积比为4-6:1；所述虫胶纳米颗粒分散液质量浓度为0-2wt.％，其中虫胶纳米颗粒直径为100-200nm；所述交联剂为质量浓度为5-15mg/mL京尼平水溶液，体积浓度为2-10％v/v的戊二醛水溶液或质量浓度为1-8mg/mL香草醛水溶液中的一种。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液的具体制备方法如下：
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述含司盘80的液体石蜡的浓度为0.04-0.08g/mL，水相和液体石蜡相比为1:1-3，高速剪切均质条件为转速10000-14000rpm，时间1-3min。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述念珠菌属脂肪酶酶液与酸性壳聚糖溶液的体积比为1:1-3，其中脂肪酶酶液的脂肪酶浓
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳液A和乳液B的体积比为0.8-1.2:1；所述融合交联和失水收缩的条件为：开放式恒温水浴搅拌，温度为30-45℃，转速为500-1500rpm，时间为40-60h。
7.一种固定化脂肪酶，其特征在于，根据权利要求1至6任一项所述的制备方法制备得到。
8.一种根据权利要求7所述的固定化脂肪酶在Pickering界面催化中的应用，其特征在于，所述应用具体包括：将酸醇溶液与去离子水混合，加入固定化脂肪酶，恒温搅拌进行反应。
9.根据权利要求8所述的固定化脂肪酶在Pickering界面催化中的应用，其特征在于，所述酸醇溶液为己酸和己醇的正己烷溶液，己酸和己醇在正己烷溶液中的浓度为0.3-0.5mol/L；所述酸醇溶液和去离子水比为1-2:1；所述固定化脂肪酶的在反应体系中的质量浓度为20-50mg/mL。
10.根据权利要求8所述的固定化脂肪酶在Pickering界面催化中的应用，其特征在于，所述恒温搅拌条件：温度为35-45℃，转速为300rpm，反应时间为10-14h。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液和京尼平水溶液的体积比为4-6:1；所述虫胶纳米颗粒分散液质量浓度为0-2wt.％，其中虫胶纳米颗粒直径为100-200nm；所述交联剂为质量浓度为5-15mg/ml京尼平水溶液，体积浓度为2-10％v/v的戊二醛水溶液或质量浓度为1-8mg/ml香草醛水溶液中的一种。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述虫胶纳米颗粒分散液的具体制备方法如下：
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述含司盘80的液体石蜡的浓度为0.04-0.08g/ml，水相和液体石蜡相比为1:1-3，高速剪切均质条件为转速10000-14000rpm，时间1-3min。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述念珠菌属脂肪酶酶液与酸性壳聚糖溶液的体积比为1:1-3，其中脂肪酶酶液的脂肪酶浓度为0.05-0.2g/ml，脂肪酶酶液用磷酸根浓度为5-15mm，ph为7.0-8.0的磷酸缓冲液预先稀释4...
【专利技术属性】
技术研发人员：张霞，杨塘榆，宋煜婷，何诗琪，李冰，李琳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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