【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物样本检测，具体涉及一种基于液质联用快速定量检测生物样品中甲基丙二酸的方法。
技术介绍
1、维生素b12(vb12)，又称钴胺素，是唯一含金属元素的维生素，在人体内以辅酶形式参与dna合成及红细胞再生等人体代谢反应。vb12的缺乏可能引起相关氨基酸及有机酸的代谢紊乱，从而直接或间接影响儿童的生长发育，孕期vb12的缺乏不仅会对孕妇造成影响，还与胎儿神经管缺陷、宫内生长受限和低出生体重具有相关性。然而vb12因其稳定性差、在体内含量低、代谢循环复杂和与其他物质相互干扰等原因，难以通过液质精准检测。vb12的水平可以通过血液中的甲基丙二酸(mma)水平来确定。当vb12的摄入或吸收受到限制时，体内的mma水平会升高。因此，通过测量mma的水平，可以判断vb12的摄入或吸收是否正常。然而基于我们前期液质检测mma的结果，mma仍然存在响应低、基线高以及难以与琥珀酸实现基线分离等问题。
2、mma属于一种有机小分子酸，研究人员一般通过化学衍生化来提高这类代谢物的检测灵敏度，而然目前对mma衍生化的方法操作复杂，反应时间长，不利于临床检测。如微量随机尿液中多种氨基酸和有机酸定量方法及其在维生素b12营养状况及相关代谢的初步应用[j].中国医学科学院学报,2022,44(06):941-949.一文中，在尿液样本中加入二硫苏糖醇进行沉淀、加入饱和盐酸正丁醇进行衍生化，该方法需要加热、氮吹，前处理时间长，操作复杂；又如专利cn109298115b将生物样本以甲醇、氯仿和水的混合溶剂萃取，加入相同体积的3-硝基苯肼甲
3、本专利所需分析的血浆样本基质复杂，存在大量蛋白，需要更加有效和低成本的去除蛋白的手段。鉴于现有技术的不足，需要开发一种简单易操作，快速准确，成本低的mma检测方法，以提高生物样本中的mma检测灵敏度和方法的耐用性。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于液质联用快速定量检测生物样品中甲基丙二酸的方法，具有简单易操作，快速准确的效果，通过新的衍生化方法对生物样品中的甲基丙二酸进行衍生化，显著提高甲基丙二酸的色谱响应，显著提高检测灵敏度；且通过蛋白沉淀剂进行简单的蛋白沉淀，就充分去除了样本中的蛋白杂质，显著提高了检测准确性并避免蛋白残留对色谱柱造成伤害。
2、一方面，本专利技术提供了一种基于液质联用快速定量检测生物样品中甲基丙二酸的方法，包括对生物样品的衍生化，所述衍生化采用的衍生化试剂为edc和tfea。
3、本专利技术采用edc和tfea作为衍生化试剂，edc全名为n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐，tfea全名为2,2,2-三氟乙胺盐酸盐；现有的mma衍生化技术操作复杂，衍生化反应时间长，不利于临床检测。本专利技术将edc和tfea应用于生物样本的mma衍生化，与其他生物样本中的mma衍生化方法相比，仅需少量的衍生化试剂，衍生化时间短，不需要加热和氮吹，只需在室温反应10min，后用10％tca沉淀蛋白，离心取上清即可进液质检测，检测时间短，只需5min。lc-ms/ms检测结果表明，衍生化后的mma响应显著被提高，利于定量分析的进行。
4、进一步的，所述衍生化过程中，发生了如下反应：
5、
6、本专利技术提供的这一衍生化方法是基于大量实验和理论研究而得到的，edc中含有n＝c＝n，可用于活化mma中的两个羧基，生成中间络合物，该络合物被亲电试剂tfea攻击，这种攻击取代碳二亚胺生成相应的酰胺。tfea因其带有-cf3基团，产生的衍生化mma中含有氟化酰胺基团，具有优异的色谱性能，并且在质谱分析过程中也会产生大量的分子离子，有利于色谱的检测；且上述原理得到了本专利技术大量实验结果的支持。
7、进一步的，所述衍生化试剂edc的溶剂为二甲基亚砜。
8、本专利技术通过试验证明了，大多数常规的用于溶解edc的溶剂是不合适作为本专利技术中的衍生化试剂edc的溶剂的，因为edc在其中不稳定，可能在溶液配制到衍生化结束这一时间中edc的衍生化活性就急剧降低了，那么mma-d(衍生化后的mma)的色谱响应也急剧降低；或是有机溶剂分子会对edc的衍生化活性产生抑制，相同地mma-d的色谱响应也降低。
9、通过大量试验和理论研究，本专利技术确认衍生化试剂edc的溶剂为二甲基亚砜，其能够极大程度保证edc的稳定性，维持edc的衍生化活性不受抑制，当edc的溶剂为二甲基亚砜时mma-d的初始色谱响应最高，edc溶液保存一段时间后mma-d的色谱响应下降程度低。
10、进一步的，所述衍生化试剂edc和tfea的浓度均为1.0m。
11、进一步的，所述生物样品与衍生化试剂edc和tfea的体积比为10:1:1。
12、进一步的，所述衍生化为，将生物样品、内标、衍生化试剂edc和tfea涡旋混匀后，在室温反应10min。
13、衍生化时间与mma-d色谱响应存在明显关联，随着衍生化时间的增加mma-d色谱响应增加，但继续增加衍生化时间mma-d响应并没有得到进一步的提高，还存在降低的趋势，因此最优的衍生化时间为10min。
14、现有技术中衍生化前往往有加入缓冲液这一步，本专利技术在衍生化前减去了加入缓冲液这一步，发现衍生化效果也很显著。本专利技术的mma衍生化方法过程中不需要加热，氮吹等步骤，反应时间短，对于10体积的样本，分别加入1体积的edc和tfea(10:1:1)，衍生化效果好，衍生化过程时间更短，仅需室温放置10min。
15、进一步的，还包括蛋白沉淀，所述蛋白沉淀步骤在衍生化步骤之后，所述蛋白沉淀采用的蛋白沉淀剂为10％三氯乙酸。
16、本专利技术使用10％tca作为蛋白沉淀剂，tca即三氯乙酸；在我们的实验过程中发现，10％tca具有好的蛋白沉淀效果，经过10％tca沉淀的血浆样本离心之后上清液清澈无杂质，减少对色谱柱的伤害。我们所加的10％的三氯乙酸，其酸性很强，不利于mma的衍生化，所以我们选择先衍生化后再蛋白沉淀，实验结果表明，先衍生化后再蛋白沉淀的方法取得了良好的效果，显著提高了mma在色谱中的响应。
17、进一步的，所述蛋白沉淀为，加入与衍生化后混合液体积比1:1的10％三氯乙酸，涡旋混匀，室温沉淀，离心取上清液作为待测液。
18、进一步的，还包括液相色谱串联质谱上机检测，进样5μl待测液。
19、进一步的，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于液质联用快速定量检测生物样品中甲基丙二酸的方法，其特征在于，包括对生物样品的衍生化，所述衍生化采用的衍生化试剂为EDC和TFEA。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述衍生化过程中，发生了如下反应：
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述衍生化试剂EDC的溶剂为二甲基亚砜。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述衍生化试剂EDC和TFEA的浓度均为1.0M。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述生物样品与衍生化试剂EDC和TFEA的体积比为10:1:1。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述衍生化为：将生物样品、内标、衍生化试剂EDC和TFEA涡旋混匀后，在室温反应10min。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，还包括蛋白沉淀，所述蛋白沉淀步骤在衍生化步骤之后，所述蛋白沉淀采用的蛋白沉淀剂为10％三氯乙酸。
8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述蛋白沉淀为，加入与衍生化后混合液体积比1:1的10％三氯乙酸，涡旋混匀，室温沉淀，离心取上清液作为待测液。<...
【技术特征摘要】
1.一种基于液质联用快速定量检测生物样品中甲基丙二酸的方法，其特征在于，包括对生物样品的衍生化，所述衍生化采用的衍生化试剂为edc和tfea。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述衍生化过程中，发生了如下反应：
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述衍生化试剂edc的溶剂为二甲基亚砜。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，所述衍生化试剂edc和tfea的浓度均为1.0m。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述生物样品与衍生化试剂edc和tfea的体积比为10:1:1。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述衍生化为：将生物样品、内标、衍生化试剂edc和tfea涡...
【专利技术属性】
技术研发人员：施红军，沈丹红，刘锦狄，
申请(专利权)人：西湖维泰杭州诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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