红细胞叶酸的检测方法技术

本发明专利技术提供了红细胞叶酸的检测方法，所述方法包括：(1)红细胞准备程序，其中制成红细胞悬液，检测红细胞悬液的红细胞压积，或者制成红细胞裂解液，检测红细胞裂解液的血红蛋白浓度；(2)叶酸提取和检测，其中对叶酸提取所得上清液进行叶酸LC

【技术实现步骤摘要】
红细胞叶酸的检测方法


[0001]本专利技术涉及叶酸检测领域，具体而言，涉及红细胞叶酸的检测方法。

技术介绍

[0002]叶酸水平与生殖健康密切相关。叶酸水平临床检测分血清(血浆)检测和红细胞检测两种。
[0003]目前血清(血浆)检测技术比较成熟，其检测方法有三种：微生物法、蛋白结合法和液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)。
[0004]微生物法利用乳杆菌生长速度对叶酸敏感的原理，通过测量经过一定时长生长后的细菌的浑浊度来反映培养液中添加的叶酸的浓度(Grossowicz,N.,et al.,Determination of folic acid metabolites in normal subjects and in patients with nutritional megaloblastic anemia.Proc Soc Exp Biol Med,1962.109:p.770
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3.)。
[0005]微生物法被临床营养学界公认为叶酸检测的金标准，常被新方法用来进行性能对比(Yetley,E.A.,et al.,Biomarkers of folate status in NHANES:a roundtable summary.Am J Clin Nutr,2011.94(1):p.303S
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312S)。微生物法的主要缺点是检测耗时长，一般需要3天时间，对无菌操作要求高，不利于商业推广。
[0006]自从上世纪70年代，基于蛋白结合原理的商业检测试剂盒得到广泛应用一直到今天。国际上主要的试剂盒厂家包括RocheFolate III和Beckman Coulter Access Folate assay等，其检测主要是基于内源性叶酸和外源性标记的叶酸对叶酸结合蛋白的竞争性结合原理,利用化学发光产生信号的蛋白结合法(protein binding assay)。
[0007]近年来基于液相色谱
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串联质谱(LC
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MS/MS)的检测方法也逐渐被广泛用于血清叶酸检测，并显示出非常好的特异性和敏感度(Verstraete,J.,et al.,Clinical determination of folates:recent analytical strategies and challenges.Anal Bioanal Chem,2019.411(19):p.4383
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4399.)。
[0008]血清学检测的主要缺点在于其反映的是近期叶酸摄入量，容易受一过性膳食因素的影响，波动性大，其浓度对避免出生缺陷的参考价值并没有得到学术界的广泛认可。WHO在一份预防神经管缺陷的营养学指南中指出育龄妇女的血清或血浆叶酸阈值对预防神经管缺陷是不充分的；红细胞叶酸浓度必须达到906nmol/L以上才能最大化的预防神经管缺陷(Cordero,A.M.,et al.,Optimal serum and red blood cell folate concentrations in women of reproductive age for prevention of neural tube defects:World Health Organization guidelines.MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2015.64(15):p.421
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3.)。
[0009]相对血清叶酸，红细胞叶酸反映了体内叶酸长期存储水平，不易受近期叶酸摄入的影响，被很多学者认为是更好的叶酸指标(Farrell,C.J.,S.H.Kirsch,and M.Herrmann,Red cell or serum folate:what to do in clinical practice？Clin Chem Lab Med,
testing for folate deficiency:new features？European Journal of Haematology,2014.92(4):p.354
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359.)。这种方法由于忽略了血浆叶酸的贡献及占比的差异性，会造成红细胞叶酸浓度高估和不准确。第二种方法是先测得红细胞压积和全血叶酸浓度，再将同一管血离心取得血浆，测得血浆叶酸浓度，再根据公式“红细胞叶酸＝[全血叶酸
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血浆叶酸(1
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红细胞压积)]/红细胞压积”估算出红细胞叶酸(Hoffbrand,A.V.,B.F.A.Newcombe,and D.L.Mollin,Method of assay of red cell folate activity and the value of the assay as a test for folate deficiency.Journal of Clinical Pathology,1966.19(1):p.17
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28；Huang,Y.,et al.,Quantification of key red blood cell folates from subjects with defined MTHFR 677C>T genotypes using stable isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry.Rapid Commun Mass Spectrom,2008.22(16):p.2403
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12.)。这种方法的缺陷是需要分别做血浆和全血的叶酸检测，增加了检测误差和成本。
[0016]在全血叶酸提取方面，目前常规做法是往一份EDTA全血中加入4
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9倍体积的1％抗坏血酸，37℃或常温孵育30
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120分钟左右后，将之加入固相萃取柱子中，经过洗涤后用含有甲醇、乙腈、乙酸、抗坏血酸的溶液将叶酸洗脱下来。这样经过纯净和浓缩后的叶酸可直接(Fazili,Z.and C.M.Pfeiffer,Measurement of Folates in Serum and Conventionally Prepared Whole Blood Lysates:Application of an Automated 96
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Well Plate Isotope
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Dilution Tandem Mass Spectrometry Method.Clinical Chemistry,2004.50(12):p.2378
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2381.)或氮气吹干再复溶后进入液相色谱
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串联质谱进行检测(Huang,Y.,et al.,Quantification of key red blood cell folates from subjects w本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种红细胞叶酸的检测方法，该方法包括以下步骤：(1)红细胞准备程序S1，将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃保存和运输，最长72小时内进行如下操作：使用0至4℃等渗无毒性液体润洗红细胞至少1次并制成红细胞悬液；检测红细胞悬液的红细胞压积；或者，S1
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，将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃保存或运输，最长72小时内进行如下操作：使用0至4℃等渗无毒性液体润洗红细胞至少1次，离心，收集红细胞，在
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40至
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80℃冻存；向冻存的红细胞中加入两倍红细胞体积的1％抗坏血酸溶液，使红细胞解冻混悬，制成红细胞裂解液；检测红细胞裂解液的血红蛋白浓度；(2)叶酸提取和检测分别向S1中得到的红细胞悬液或S1
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中得到的红细胞裂解液和叶酸标准品溶液中加入叶酸提取液，37℃孵育30min
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2h；再使用能够沉淀蛋白质的化学试剂去蛋白，得到上清液，直接对上清液进行叶酸LC
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MS/MS检测，并根据标准品浓度计算出红细胞悬液或红细胞裂解液中叶酸的浓度；(3)叶酸浓度计算根据以下公式计算叶酸浓度红细胞叶酸浓度＝红细胞悬液中叶酸浓度/红细胞悬液的红细胞压积；或红细胞叶酸浓度＝红细胞裂解液中叶酸浓度/(红细胞裂解液血红蛋白浓度*0.0029)。2.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，本发明步骤(1)中，所述等渗无毒性液体是指能够用于红细胞润洗过程的pH中性的等渗无毒性液体。3.根据权利要求2所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，所述等渗无毒性液体为生理盐水或磷酸缓冲液。4.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，S1包括以下步骤：将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃避光暂存，72小时内0至4℃下避光运输至检测实验室；检测实验室收到样本后，完成以下操作：离心分离血浆，弃上清，加入等渗无毒性液体；混匀，离心，弃上清，加入两倍红细胞体积的等渗无毒性液体，制作成红细胞等渗无毒性液体悬液。5.根据权利要求1所述的红细胞叶酸的检测方法，其中，S1
’
包括以下步骤：将空腹静脉血样置于抗凝管中，置于0至4℃避光暂存，72小时内0至4℃下避光运输至本地样本处置点：处置点收到样本后，完成以下操作：离心分离血浆，弃上清，...

【专利技术属性】
技术研发人员：施红军，
申请(专利权)人：西湖维泰杭州诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：