【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制品的应用及检测，具体是一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法。
技术介绍
1、市场上鸭肝i、iii型病毒在商品肉鸭养殖中突然集中爆发，发病急，死亡率高，一般是15-30日龄发病。鸭肝卵黄抗体注射治疗后效果不佳，反复发生，给生产带来巨大损失。
2、通过实践发现，鸭苗1日龄注射鸭肝卵黄抗体可以有效的预防早期的感染发病，但是市售的卵抗的抗体水平波动较大，不稳定。
3、传统意义上鸭肝卵黄抗体的应用主要是用于发生疾病后的治疗使用，国标的评估标准是中和效价≥1：256。取4-7日龄雏鸭30只，随机分为3组，每组10只第1组各皮下注射蛋黄抗体0.5m1第2组各皮下注射生理盐水05ml2小时后，用鸭病性肝炎强毒av2111株病毒液皮下注射第1组和第2组鸭，每只1ml(约含100ld)。第3组空白对照组，不注射任何物品。观察10日。第1接种蛋黄抗体组，雏鸭应至少8只保护。第2攻毒对照组，雏鸭应至少8只死亡第3空白对照组，应全部健活。
4、上述方案的缺点是1、鸭肝中和抗体检测方法，普遍认为是接种鸭胚进行中和试验，但是目前非免的阴性鸭胚几乎没有，且阴性鸭胚的标准不统一，因此导致鸭胚中和抗体的结果不可信。购买spf鸭胚，来源少，费用非常高，难实施。2、目前鸭肝卵黄抗体的应用方向发生变化，主要用于预防感染使用，要求有一定的免疫保护期。如果再用国标的方法进行评估，无法评估鸭肝卵抗预防效果的有效性；另外鸭肝卵抗效价多高保护期多久均无标准；鸭苗免疫抗体后的攻毒保护是检验抗体效价保护的金标准，但是操作复杂
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的实施例提供一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，通过将抗体检测方法中的鸭胚以鸡胚代替，采用鸡胚中和抗体进行检测，spf鸡胚易购买，费用较低，检测稳定，结果可信，以此得出抗体的效价，并结合攻毒保护试验的数据，可以分析出效价的保护标准，从而建立效价保护标准和攻毒保护率的相关性，在实验室推广检测方法和标准即可以有效的评估抗体产品的有效性，取代每批次检验的实验动物的攻毒保护试验的这种评价方式，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，包括以下步骤：
4、s1.将鸭肝i、ⅲ的流行毒株进行鸡胚传代，扩得毒种，测其毒价用于中和抗体的检测；
5、s2.通过鸡胚中和，测得卵抗抗体的效价；
6、s3.通过不同效价的卵抗进行鸭苗1日龄注射后，7天进行攻毒保护试验，以分组的方式，分别进行鸭肝i和鸭肝ⅲ的攻毒，观察试验鸭的死亡情况，获得攻毒保护100％的效价标准。
7、作为本专利技术再进一步的方案，所述s1包括有以下步骤：
8、s1-1检测毒株：通过将鸭肝i和ⅲ按照不同的接种方式，适应鸡胚的生长，其中，鸭肝i型接种鸡胚尿囊腔，鸭肝ⅲ型接种鸡胚卵黄囊，得到鸡胚适应毒株；
9、s1-2毒价测定：病毒eld50的测定。
10、作为本专利技术再进一步的方案，所述s1-2包括有以下步骤：
11、s1-2-1病毒梯度稀释：将稀释管置于离心管架上依次摆开，用移液枪在每个离心管中加入900微升的pbs，再吸取病毒液100微升加入装有pbs的第一个离心管中(吸取液体或加样时润洗一次枪头)，将第一个离心管中的病毒液与pbs涡旋混匀后再吸取100微升加入第二个装有pbs的离心管中(注意枪头的润洗)以此类推，病毒进行10倍的倍比稀释10-1、10-2、10-3……10-10；
12、s1-2-2鸡胚接种：选取适当的梯度进行鸡胚接毒，用照蛋器照胚，画出进针孔，记号笔标记好接毒的编号，然后碘伏将整个气室进行消毒，作用15分钟，进行酒精脱碘，放入消毒好的超净台进行鸡胚的接毒工作，将打孔器灼烧灭菌在鸡胚进针孔处打孔，用1ml注射器吸取接种的病毒液进行接种，每个梯度接种五枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.1ml，接种完毕后用固体石蜡进行封孔，放置到37℃温箱进行孵化培养；
13、s1-2-3接毒鸡胚死亡情况观察：在鸡胚接毒后每天进行照胚，无血管的、血管破裂的判定为死胚，早晚各照一次，24小时内死亡的鸡胚弃去不计算，观察7天之后统计每个梯度死亡鸡胚的数量进行毒价的计算。
14、作为本专利技术再进一步的方案，所述s2包括有以下步骤：s2-1样品稀释、s2-2中和反应、s2-3接胚前的准备工作、s2-4鸡胚接种、s2-5鸡胚死亡情况观察、与s2-6按reed-muench两氏法或karber进行计算。
15、作为本专利技术再进一步的方案，所述s2-1样品稀释包括以下步骤：
16、待检抗体的稀释：将稀释管在稀释管架依次摆开，样品用pbs的2倍倍比稀释，即在每个稀释管中加入400微升pbs，用移液枪再取400微升样品液加入第1个稀释管(注意润洗枪头次数的一致性)，待第一个稀释管中样品与稀释液用涡旋仪充分混匀后，吸取400微升混合好的液体加入第二个离心管，依次类推，最后一个稀释度将抽出的400微升混合液弃去，使之呈1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128……；
17、病毒的稀释：固定病毒稀释血清法是指将病毒的浓度稀释到200eld50，例如：毒价为105.84eld50/0.1ml，将病毒稀释成每单位计量含200eld50的稀释倍数＝105.84/200≈3500(为方便举例)，将稀释管在架子上依次摆开先将病毒稀释5倍(100微升毒+400微升pbs)在涡旋仪上充分混匀，进行7倍稀释(吸取稀释5倍的毒100微升+600微升pbs)涡旋仪充分混匀，进行10倍稀释(吸取稀释7倍的毒100微升+900微升pbs)涡旋仪充分混匀，进行10倍稀释(吸取上一步稀释10倍的毒100微升+900微升pbs)涡旋仪充分混匀，共稀释3500倍得到每单位计量含200eld50/0.1ml的毒；
18、病毒对照的稀释：中和实验需要进行对照组的设置，及病毒浓度为100eld50、10eld50、1eld50、0.1eld50。
19、作为本专利技术再进一步的方案，所述s2-2中和反应包括以下步骤：将稀释成每单位计量含200eld50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品充分混匀(样品：病毒＝1：1)，放入37°温箱中中和1小时。
20、作为本专利技术再进一步的方案，所述s2-3接胚前的准备工作包括以下步骤：
21、照胚：将鸡胚用照蛋器照胚，挑出无精蛋弃去，用铅笔标记好进针孔位置注意避开胚体和大血管；
22、标记：接种鸡胚的稀释度编号，每个稀释度接种4枚鸡胚；
23、消毒：用碘酊将整个气室进行消毒，并作用一定时间；
24、脱碘：酒精棉球擦拭气室进行脱碘。
25、作为本专利技术再进一步的方案，所述s2-4鸡胚接种包括以下步骤：...
【技术保护点】
1.一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S1包括有以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S1-2包括有以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S2包括有以下步骤：S2-1样品稀释、S2-2中和反应、S2-3接胚前的准备工作、S2-4鸡胚接种、S2-5鸡胚死亡情况观察、与S2-6按Reed-Muench两氏法或Karber进行计算。
5.根据权利要求4所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S2-1样品稀释包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S2-2中和反应包括以下步骤：将稀释成每单位计量含200ELD50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品充分混匀(样品：病毒＝1：1)，放入37°温箱中中和1小时。
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8.根据权利要求4所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S2-4鸡胚接种包括以下步骤：
9.根据权利要求4所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述S2-5鸡胚死亡情况观察包括以下步骤：鸡胚解毒后每天早晚各进行照蛋一次，24小时内死亡的鸡胚弃去不统计，7天后将鸡胚每个梯度死亡的数量做一个统计，并观察对照试验是否成立，准备中和效价的计算。
...【技术特征摘要】
1.一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述s1包括有以下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述s1-2包括有以下步骤：
4.根据权利要求1所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述s2包括有以下步骤：s2-1样品稀释、s2-2中和反应、s2-3接胚前的准备工作、s2-4鸡胚接种、s2-5鸡胚死亡情况观察、与s2-6按reed-muench两氏法或karber进行计算。
5.根据权利要求4所述的一种鸭甲型肝炎病毒免疫抗体效力评价的方法，其特征在于，所述s2-1样品稀释包括以下步骤：
6.根据权利要求4所述的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：许明清，汪建华，张中波，马芹，褚新星，王胜，
申请(专利权)人：山东和康源生物育种股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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