【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种基于小分子质谱探针检测含伯氨基生物活性肽的方法。
技术介绍
1、生物活性肽是有机体中涉及各种细胞功能的生物活性物质，包括细胞因子、生长激素和体液中某些蛋白的特异降解片段等，它们参与有机体的多种生理调节，包括激素调节、神经递质调节、细胞生长与增殖调节，以及免疫调节等多个方面。研究生物活性肽的结构和生理功能在生命科学中意义重大。目前，生物活性肽的分析方法主要是质谱法、核磁共振法等。其中，质谱作为一种具有高灵敏度和高特异性的非标记检测技术，广泛用于生物活性肽的定性定量检测。一方面，质谱在无需扩增或标记的情况下，可实现多种生物分子的同步检测。其次，质谱通过多级碎裂的方式，利用分子的特征碎片信息还可以实现未知化合物的结构解析。然而，尽管质谱具有较高的灵敏度，但绝大多数样本中生物活性肽的含量极低，质谱法仍然难以直接检测到。为了克服这些困难，目前主要采用富集、质谱探针技术、柱前衍生化等方法实现生物活性肽的质谱定性定量分析。然而，这些方法通常需要大量的生物样本，不利于临床微量样本的研究。此外，大多数质谱探针，如三苯基膦质谱探针、tandemmass tagtm(tmttm)试剂等方法是在提取目标分子后进行标记，且标记反应过程中往往需要加入有机溶剂。而生物样本提取过程可能会损失一些重要的分子信息。在活细胞中直接标记有可能消除样本提取过程中造成的损失，但有机溶剂反应条件限制了这些探针在活细胞中的应用。另一方面，尽管tmt试剂等可以实现高丰度生物活性肽的定量检测，但不能提高多肽的质谱响应难以实现低丰度生物活性肽的定
2、根据质谱测试原理，带有电荷的基团(如季铵类化合物)在质谱检测过程中容易离子化而带上电荷，其质谱响应显著高于难以离子化的物质。因此，将这类基团引入目标分子中，可显著提高目标分子的质谱信号，实现超灵敏检测。然而，如上所述，将这些基团标记到活细胞中的生物活性肽上仍具有挑战。如市售的蛋白衍生化试剂tmt是通过n-羟基琥珀酰亚胺酯活化的羧基基团与待测物上的伯氨基特异性反应，实现目标分子的标记。尽管这些技术目前已经较为成熟，但其仍有以下缺点：①通常需要胞外反应，难以实现活细胞内生物活性肽的实时标记；②n-羟基琥珀酰亚胺酯稳定性差，易水解，故而标记效率低；③大多数质谱探针不能有效提高生物活性肽的质谱响应。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术构建了一种带有电荷的小分子质谱探针，其可通过光催化点击化学与细胞内含有伯氨基的生物活性肽反应，实现胞内生物活性肽的快速、高效标记，且可显著提高生物活性肽的质谱响应。该专利技术为质谱分析生物活性肽提供了有力工具。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种含伯氨基生物活性肽的检测方法，包括以下步骤：
3、s1、将甜菜碱与含氨基的苯化合物反应使两者通过酰胺键连接，得到检测探针(ttnm探针)；
4、s2、将s1得到的检测探针进行紫外照射，随后与含有伯氨基生物活性肽的待测样品共孵育；
5、s3、采用质谱对孵育结束后的待测样品进行检测，实现含伯氨基生物活性肽的检测；
6、其中，含氨基的苯化合物通过苯环上任意两个相邻位置的氢原子分别被硝基和羟甲基取代，苯环上其余任意位置氢原子被结构式i所示的结构取代得到：
7、
8、其中，r1选自-o-、-s-或c1～10的烷基。
9、本专利技术中，ttnm探针是通过光催化点击化学反应与伯氨基发生反应，反应效率高，且不受细胞内外环境影响，可实现活细胞内生物活性肽的高效标记。此外，ttnm探针兼有带电荷分子，因此可显著提高生物活性肽的质谱响应。
10、进一步地，所述苯化合物优选为如下结构：
11、
12、进一步地，苯化合物最优选为(4-氨基-2-硝基苯基)甲醇。
13、进一步地，所述含有伯氨基生物活性肽的待测样品可为含有伯氨基生物活性肽的混合液，也可为含有伯氨基生物活性肽的细胞。
14、进一步地，所述细胞为活细胞。
15、进一步地，所述紫外照射为采用350-380nm的紫外光照射。
16、本专利技术的第二个目的是提供一种小分子质谱探针，所述小分子质谱探针包含如下结构：
17、苯化合物，所述苯化合物的苯环上任意两个相邻位置的氢原子分别被硝基和羟甲基取代，苯环上其余任意位置氢原子被结构式i所示的结构取代，且被结构式i所取代的位置上，其中的氨基通过酰胺缩合与甜菜碱结合；结构式i如下所示：
18、
19、其中，r1选自-o-、-s-或c1～10的烷基。
20、本专利技术的第三个目的是提供所述小分子质谱探针的制备方法，包括以下步骤：
21、将甜菜碱上的羧基活化，并与苯化合物上的氨基反应，两者混合进行酰胺化反应，得到所述小分子质谱探针。
22、本专利技术的第四个目的是提供所述小分子质谱探针在制备含伯氨基的生物活性肽的检测产品中的应用。
23、本专利技术的第五个目的是提供所述小分子质谱探针在制备疾病诊断产品中的应用。所述疾病为与生物活性肽异常相关的疾病。
24、本专利技术的有益效果：
25、目前尚未见探针可以同时实现活细胞内生物活性肽的高效标记并提高其质谱响应。本专利技术在质谱分析原理的基础上联合光催化点击化学反应，将带电荷的甜菜碱与(4-氨基-2-硝基苯基)甲醇通过简单的酰胺化反应共价结合，得到质谱探针(4-三甲基乙酰胺-2-硝基苯基)甲醇((4-trimethylacetamide-2-nitrophenyl)methanol)，即ttnm。ttnm探针与细胞共孵育后于365nm紫外光下照射10-15分钟后即可实现细胞内含有伯氨基化合物的高效标记。另一方面，甜菜碱是带电荷的季铵盐，其可有效提高生物活性肽的质谱响应，实现超灵敏定性定量分析。
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1.一种含伯氨基生物活性肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含氨基的苯化合物为如下结构：
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述含氨基的苯化合物为(4-氨基-2-硝基苯基)甲醇。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有伯氨基生物活性肽的待测样品为含有伯氨基生物活性肽的混合液，或含有伯氨基生物活性肽的细胞。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述细胞为活细胞。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述紫外照射为采用350-380nm的紫外光照射。
7.一种小分子质谱探针，其特征在于，所述小分子质谱探针包含如下结构：
8.权利要求7所述的小分子质谱探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.权利要求7所述的小分子质谱探针在制备含伯氨基的生物活性肽的检测产品中的应用。
10.权利要求7所述的小分子质谱探针在制备疾病诊断产品中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种含伯氨基生物活性肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含氨基的苯化合物为如下结构：
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述含氨基的苯化合物为(4-氨基-2-硝基苯基)甲醇。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含有伯氨基生物活性肽的待测样品为含有伯氨基生物活性肽的混合液，或含有伯氨基生物活性肽的细胞。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈芸，朱建华，曹骁，陈浩然，
申请(专利权)人：苏州南医大创新中心，
类型：发明
国别省市：
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