【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及一种检测活细胞上三聚体蛋白的方法及检测探针组合物。
技术介绍
1、蛋白质是生物分子网络的重要组成部分之一。研究表明大多数蛋白质在执行功能时，通常与其他分子结合或者自行聚集以发挥作用，而不是单独发挥作用。在聚集过程中，可以产生由两个或两个以上的蛋白质单体组成的蛋白质复合物，即蛋白质多聚体。多聚体蛋白质根据蛋白质单体的数量，以二聚体、三聚体和更高的复合物的形式存在。多聚体蛋白的亚基可以像同聚体蛋白一样相同，也可以像异聚体蛋白一样不同。有证据表明，多聚体蛋白约占自然界蛋白质总量的30％。
2、迄今为止，许多研究报道了不同聚合状态的多聚体蛋白具有不同的生物学功能。在这些多聚蛋白中，膜多聚蛋白因其作为生物标志物和治疗靶点的潜在作用而最具吸引力。此外，不同表达水平的多聚体蛋白也会影响它们的生物学行为。例如，tnf-α作为肿瘤坏死因子(tnf)超家族的成员，其三聚体(tmtnf-α)形式活性高于单体和二聚体。此外，正常水平的tmtnf-α三聚体可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤生长，而过表达tmtnf-α三聚体可刺激肿瘤细胞的增殖、迁移和血管生成。因此，准确识别和定量检测这些蛋白三聚体可以更好地理解复杂的生物过程，发现潜在的生物靶标。
3、目前，常用的多聚体蛋白检测技术主要有邻位连接技术(pla)、免疫共沉淀法(co-ip)、交联质谱法(xl-ms)和分子排阻色谱法(sec)。然而，这些技术在膜蛋白多聚体检测中均有着不同程度的限制。如pla技术由于其固有的检测原理和不可量化的扩增，并且荧
4、近期，有研究采用质谱探针联合质谱成功实现了活细胞表面蛋白同源二聚体和异源二聚体的定量检测。质谱探针通常由靶标识别部分、控释系统以及质谱标签分子三部分组成。靶标识别部分可特异性识别目标分子，然后通过控释系统释放出质谱标签分子。最后，采用质谱检测所释放出的质谱标签分子即可将目标分子的量化信息转化为质谱标签分子的质谱信号。因此，质谱探针是定量检测活细胞表面多聚体蛋白的有力工具。然而，现有的质谱探针难以有效区分蛋白质单体和三聚体，从而对三聚体进行分析检测。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术开发了一种dna四面体质谱探针集联合质谱实现活细胞表面三聚体蛋白的定量检测。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种检测活细胞上三聚体蛋白的方法，包括以下步骤：
3、(1)将待测细胞与识别和置换探针共孵育(使探针上的适配体与三聚体中的三个单体分别特异性结合)，反应结束后洗去未结合探针；
4、(2)向步骤(1)的产物中加入dna四面体探针和标记探针共孵育，使体系发生链置换反应(即s4与s1～s3脱离，而与三个单体上的三条rd序列结合，暴露标记探针杂交部位)，反应结束后收集细胞，使用特定手段在不破坏细胞的前提下将标记探针中的检测标记断开，对检测标记进行表征，实现三聚体蛋白的检测；其中，
5、所述识别和置换探针由三聚体中单体的适配体及与其连接的rd序列组成，所述rd序列上设有相互连接的rd1、rd2和rd3序列；
6、所述dna四面体探针由s1、s2、s3和s4链自组装得到，s1链上设有相互连接的s11、s12和s13序列，s2链上设有相互连接的s21、s22和s23序列，s3链上设有相互连接的s31、s32和s33序列，s4链上设有相互连接的s41、s42、s43和s44序列；
7、s11与s31反向互补，s12与s22反向互补，s23与s33反向互补，且s13、s21、s32序列相同，s41上(从5’端到3’端)设有相互连接的s411、s412和s413序列，且s411与s413序列互补使s41形成发夹结构，s42上设有与s13的(反向)互补序列和非互补序列，s43上设有与s32的(反向)互补序列和非互补序列，s44上设有与s21的(反向)互补序列和非互补序列，且以上所有非互补序列相同；
8、所述标记探针上设有相互连接的m1和m2序列，且在m2序列远离m1的一端可断开式连接有检测标记；
9、所述rd1与s4中的非互补序列反向互补，所述rd2与s4中的互补序列反向互补，所述rd3与s413反向互补，所述m1与s412反向互补，所述m2与s411完全(反向)互补或部分(反向)互补。
10、本专利技术中，
11、1)dna四面体探针(t probe)的四个面均为三角形。选择其中一个面作为基本平面来匹配三聚体的表面。选择形成基本平面的完整dna链作为基本链，在三角形的顶点留下一条含有6-10个碱基的单链作为起始链置换反应的支点区域，在三角形每一个顶点处都隐藏着一个同样含有6-10个碱基的发夹结构，用于驱动链置换反应。
12、2)识别和置换探针(r&d probe)分为识别部分和置换部分。每个探针的识别链可以分别与三聚体蛋白的一个单体和dna四面体的一个支点区提前特异性结合。然后，驱动链置换反应，取代原有的基本双链结构，形成新的更稳定的双链结构。理论上，只有一步一步完成各侧链的置换反应，才能依次识别出三种蛋白质单体，只有当前支点区域与识别替代探针的置换链发生反应后，dna发夹才能打开。因此，链置换反应是级联的，该过程可以串联三聚体蛋白的所有单体信息。
13、3)质量标记探针(m probe)由用于杂交的单链dna、控释系统和质谱标签分子三部分组成，依次执行“杂交”、“释放”和“检测”功能。质量标记探针与暴露出的位点杂交后，在光照下即可释放质谱标签分子。最后，得到的质谱标签分子的质谱信号表示同三聚体的水平。
14、进一步地，所述m2序列与检测标记通过光敏基团连接。
15、进一步地，当通过光敏基团连接时，上述步骤(2)中断开检测标记的方式为光照。
16、进一步地，所述检测标记的选择包括但不限于质谱标签分子，通过质谱法检测所述质谱标签分子。
17、进一步地，所述光敏基团与m2序列通过点击反应进行共价连接。
18、优选地，通过叠氮基团与二苯并环辛炔基团、反式环辛烯基团或双环[6.1.0]壬炔基团反应实现连接。
19、进一步地，所述s11的序列优选为acatgcctcagtcggat(seq id no.7)，所述s12的序列优选为atcaccgcttgctacac(seq id no.8)，所述s13的序列优选为tatcaacaggcagtaag(seq id no.9)，所述s23的序列优选为atgcgagg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测活细胞上三聚体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述M2序列与检测标记通过光敏基团连接。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当通过光敏基团连接时，上述步骤(2)中断开检测标记的方式为光照。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测标记包括质谱标签分子。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光敏基团与M2序列通过点击反应进行共价连接。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S11的序列如SEQ IDNO.7所示，所述S12的序列如SEQ ID NO.8所示，所述S13的序列如SEQ IDNO.9所示，所述S23的序列如SEQID NO.10所示；所述S411的序列如SEQ IDNO.11所示，所述S412的序列如SEQ ID NO.12所示，所述S413的序列如SEQ ID NO.13所示；所述S4中，非互补序列如SEQ ID NO.14所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1、S2、S3和S4链的
8.一种检测三聚体蛋白的探针组合物，其特征在于，所述探针组合物包括：
9.权利要求8所述的探针组合物在制备蛋白三聚体检测产品或疾病诊断产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，待测样本为细胞样本或非细胞样本。
...【技术特征摘要】
1.一种检测活细胞上三聚体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述m2序列与检测标记通过光敏基团连接。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当通过光敏基团连接时，上述步骤(2)中断开检测标记的方式为光照。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测标记包括质谱标签分子。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光敏基团与m2序列通过点击反应进行共价连接。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s11的序列如seq idno.7所示，所述s12的序列如seq id no.8所示，所述s13的序列如seq idno.9所示，所述s23的序列如seqid no.10所示；...
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