【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶活性检测，具体涉及一种测定多磺酸黏多糖抑制透明质酸酶活性的方法。
技术介绍
1、透明质酸酶(hyaluronidase)，一种内源性糖苷酶，可以将透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid，ha)及部分糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)降解成二糖或小分子寡糖。透明质酸酶在自然界中分布广泛，从复杂的哺乳动物，无脊椎动物、到低等的真菌、细菌和噬菌体中均有发现。透明质酸是一种广泛存在于人体组织中的高分子聚合物，它的降解主要通过透明质酸酶的作用完成。透明质酸酶可作为药物扩散剂，降解人体组织的透明质酸以增加其通透性，促进注射液的扩散；还可用于制备有生物活性的低分子量糖胺寡糖。透明质酸酶调节不仅在研究其酶促反应的复杂机制具有宝贵的价值缺，在gly-cotechnology应用和解决透明质酸相关疾病的未来医学应用方面举足轻重。所以，研究透明质酸酶抑制剂有着非常重要的意义。
2、已知的透明质酸酶抑制剂主要有金属阳离子(na+、fe2+、fe3+等)、苯乙醇苷类化合物、抗组胺药物、抗坏血酸、水杨酸盐、绣球酚、黄酮类、硫酸化寡糖等。其中koizumi已明确表示硫酸软骨素(chs)对牛睾丸透明质酸酶(bth)水解的抑制作用是由硫化程度、空间组成(由大的硫酸基团的位置决定)以及与其寡糖结构相关的对牛睾丸透明质酸酶的亲和力决定的。在进行chs寡糖对抑制bth水解的动力学分析中表示，在以ha为初始底物，使用chs4和chs6作为抑制剂时，在含有和不含有chs寡糖时测定的v值即反应速度没有显
3、多磺酸黏多糖是由若干磺酸化的d-葡萄糖醛酸与n-乙酰-d-半乳糖胺组成的二糖单元连接而成。其活性成分是脏器类低分子肝素，具有抗凝血酶作用，能有效阻止微血栓的产生。另外，它通过抑制组织中蛋白酶的分解及透明质酸酶的扩散，促进局部血液循环，加快水肿的吸收。多磺酸黏多糖还能激活组织因子旁路抑制因子tfpi，进而抑制组织因子，具有局部抗炎的作用，还能改善细胞间质的聚合作用、黏稠度、通透性及保持水分能力恢复正常。
4、目前，已经有许多方法来测定透明质酸酶活性，如透明质酸酶活性测定方法有物理法、化学法和生物指示法。然而，对于某些特殊情况，例如某些药物在治疗期间会影响透明质酸酶的活性，此时需要测定该药物对透明质酸酶的抑制活性。因此，针对多磺酸黏多糖使用后对透明质酸酶的抑制活性证明其药理作用，有必要设计一种简单、准确、敏感的方法来测定透明质酸酶的抑制活性。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种检测多糖对透明质酸酶的抑制活性的方法，该方法操作简单、准确性高，为后续多磺酸黏多糖产品药理作用的检验提供了支持。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、检测多糖对透明质酸酶的抑制活性的方法，包括如下步骤：
4、(1)配制对照品溶液：采用所述溶剂a溶解乙酰葡萄糖胺，得到对照品溶液；
5、(2)配制样品溶液：采用溶剂b溶解待测样品，得到样品溶液；
6、(3)配制系统溶液ⅰ：将步骤(1)所述底物溶液、透明质酸酶试液和溶剂b混合，得到系统溶液ⅰ；
7、(4)系统溶液ⅱ：将步骤(1)所述底物溶液、所述透明质酸酶试液和所述供试品溶液混合，得到系统溶液ⅱ；
8、(5)系统溶液ⅲ：将步骤(1)所述底物溶液和所述溶剂b混合，得到系统溶液ⅲ；
9、(6)测定：将所述对照品溶液、所述系统溶液ⅰ、所述系统溶液ⅱ和所述系统溶液ⅲ分别与酸性对二甲基氨基苯甲醛反应后，采用分光光度法测定其吸光度，计算得到透明质酸酶抑制活性；酶活测定的波长为585nm；
10、所述底物溶液为透明质酸钠试液。
11、本专利技术技术原理如下：牛睾丸透明质酸酶(bth)是其中一种内切β-n-乙酰-d-己糖胺酶，作用于透明质酸(ha)和chs的β-1，4-n-乙酰己糖胺键。透明质酸钠是透明质酸(ha)的钠盐，也称为玻璃酸钠，是一种由n-乙酰氨基葡萄糖和d-葡萄糖醛酸以1，4键相连的二糖单位直链。透明质酸酶具有催化分解透明质酸钠的能力。已知牛睾丸透明质酸酶在水解底物方面对ha的偏好高于其他低聚糖。在透明质酸酶水解透明质酸钠时，多磺酸粘多糖与透明质酸钠之间存在竞争抑制，进而降低了n-乙酰葡萄糖胺的含量。当生成的n-乙酰葡萄糖胺与稀氢氧化钾共热时，醛基和乙酰基反应生成吡咯衍生物，吡咯衍生物在盐酸酸化的对二甲基苯甲醛溶液缩合产生强紫红色，于585nm处的测吸光度。吸光值高低与颜色深浅成正比，吸光值与多磺酸粘多糖对透明质酸酶的抑制性成反比。n-乙酰葡萄糖胺的含量越高，酶活性越高，反之越低，从而精确地测定透明质酸酶抑制活性。
12、进一步，所述多糖包括多磺酸黏多糖、硫酸软骨素d、硫酸软骨素e和类肝素中的任一种或多种。
13、作为优选，透明质酸酶为牛睾丸透明质酸酶。
14、进一步，所述溶剂a为氯化钠和乙酸的混合溶液；所述溶剂b为氯化钠试液。
15、作为优选，所述溶剂b的浓度为0.15mol/l。
16、作为优选，溶剂a的配制方法如下：
17、采用0.1mol/l醋酸缓冲液溶解氯化钠，制得氯化钠-乙酸溶液(ph5.4)；将所述氯化钠-乙酸溶液(ph5.4)与0.15mol/l氯化钠试液按体积比1:1混匀，得到氯化钠和乙酸的混合溶液。
18、进一步，所述底物溶液浓度5.0mg/ml；所述透明质酸酶试液的浓度为80-130iu/ml，优选为100iu；所述样品溶液浓度为0.25ug/ml。
19、进一步，所述系统溶液ⅰ中，底物溶液、透明质酸酶试液和溶剂b的体积比为2:1:1；所述系统溶液ⅱ中，底物溶液、透明质酸酶试液和供试品溶液的体积比为2:1:1；所述系统溶液ⅲ中，底物溶液和溶剂b的体积比为2:1。
20、进一步，步骤(6)中，反应温度为37±0.5℃，反应时间为25min。
21、进一步，步骤(6)中，待测溶液先加入碱性硼酸试液进行反应，再加入酸性对二甲基氨基苯甲醛进行反应。
22、作为优选，所述碱性硼酸试液采用氢氧化钾溶液调节ph至9.1。
23、进一步，碱性硼酸试液配制方法如下：
24、硼酸试液：取硼酸如5.0g，加入50ml去二氧化碳水溶解，加氢氧化钾溶液调节ph至9.1，并加水稀释至100ml，即得。
25、进一步，步骤(6)中，系统溶液在37±0.5℃下孵育1h后，再加入碱性硼酸试液反应。
26、进一步，显色液(即酸性对二甲基氨基苯甲醛)的配制方法为：取对二甲基氨基苯甲醛如10.0g，溶于100ml 12.5％10m盐酸-冰醋酸溶液中，得到母液；将母液与冰醋酸按体积比1：9进行配制，得到显色液。
27、作为优选，步骤(6)具体如下：
28、1)分别取空白溶液和对照品溶液，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测多糖对透明质酸酶的抑制活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多糖包括多磺酸黏多糖、硫酸软骨素D、硫酸软骨素E和类肝素中的任一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂A为氯化钠和乙酸的混合溶液；所述溶剂B为氯化钠试液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液浓度5.0mg/mL；所述透明质酸酶试液的浓度为80-130IU/mL，优选为100IU；所述样品溶液浓度为0.25ug/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述系统溶液Ⅰ中，底物溶液、透明质酸酶试液和溶剂B的体积比为2:1:1；所述系统溶液Ⅱ中，底物溶液、透明质酸酶试液和供试品溶液的体积比为2:1:1；所述系统溶液Ⅲ中，底物溶液和溶剂B的体积比为2:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，反应温度为37±0.5℃，反应时间为25min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，待测溶液先加入碱性硼酸试液进行反应，
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，系统溶液在37±0.5℃下孵育1h后，再加入碱性硼酸试液反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，透明质酸酶失活速率计算公式如下：
10.试剂组合物在检测多磺酸黏多糖对透明质酸酶的抑制活性中的应用，其特征在于，所述试剂组合物包括对二甲基氨基苯甲醛、透明质酸钠、氯化钠、氯化钠和乙酸的混合溶液；所述氯化钠、氯化钠和乙酸的混合溶液作为溶剂；所述透明质酸钠作为底物；所述对二甲基氨基苯甲醛作为显色液。
...【技术特征摘要】
1.检测多糖对透明质酸酶的抑制活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多糖包括多磺酸黏多糖、硫酸软骨素d、硫酸软骨素e和类肝素中的任一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂a为氯化钠和乙酸的混合溶液；所述溶剂b为氯化钠试液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物溶液浓度5.0mg/ml；所述透明质酸酶试液的浓度为80-130iu/ml，优选为100iu；所述样品溶液浓度为0.25ug/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述系统溶液ⅰ中，底物溶液、透明质酸酶试液和溶剂b的体积比为2:1:1；所述系统溶液ⅱ中，底物溶液、透明质酸酶试液和供试品溶液的体积比为2:1:1；所述系统溶液ⅲ中，底物溶液和溶剂b的体积比为2...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹怀君，徐静，吕佳，张岩岩，
申请(专利权)人：重庆望业药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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