【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学药物分析，具体涉及一种分离、测定多磺酸粘多糖中有关物质的hplc方法。
技术介绍
1、多磺酸粘多糖(mps)，由德国mobilat produktions gmbh公司研发，其结构是由若干磺酸化的d-葡萄糖醛酸与n-乙酰-d-半乳糖胺组成的二糖单元连结而成，分子量在5000～15000道尔顿之间。多磺酸粘多糖乳膏主要治疗血栓性静脉炎(包括痔核)、基于血液循环障碍的疼痛和炎症性疾病(注射后的硬结以及疼痛)、冻疮、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩的治疗和预防、进行性指掌角皮症、皮脂缺乏症、外伤(挫伤、扭伤、挫伤)后的肿胀、血肿、腱鞘炎、肌肉痛、关节炎、肌性斜颈(婴儿期)等。
2、多磺酸粘多糖的结构式如式ⅰ所示。
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4、多磺酸粘多糖的药理作用是通过作用于血液凝固和纤维蛋白溶解系统而具有抗血栓形成作用。现有研究证实，多磺酸粘多糖通过抑制各种参与分解代谢的酶以及影响前列腺素和补体系统而具有抗炎作用；通过促进间叶细胞的合成以及恢复细胞间物质保持水分的能力从而促进结缔组织的再生。所以，多磺酸粘多糖乳膏能防止浅表血栓的形成，促进它们的吸收，阻止局部炎症的发展和加速血肿的吸收。
5、对于多磺酸粘多糖的制备，本领域通常采用硫酸软骨素作为起始物料，而硫酸软骨素中含有硫酸皮肤素(ds)及硫酸乙酰肝素，硫酸皮肤素的结构式如式ⅱ所示。硫酸皮肤素和多磺酸粘多糖的结构具有较高的相似性，分离难度较大。
6、因此，有必要对多磺酸粘多糖中硫酸皮肤素等有关物质进行分离和检测。但是目前缺少法定的多磺酸
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技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术自建高效液相色谱法，对多磺酸粘多糖及其有关物质进行检测，该方法灵敏度高，专属性强，可以实现多磺酸粘多糖中有关物质的定性和定量检测，对多磺酸粘多糖的产品的质量控制具有重要意义。
2、本专利技术的目的之一在于提供一种利用高效液相色谱法分离多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，该方法专属性强、灵敏度高，为后续多磺酸粘多糖及其有关物质的定性和定量检测提供了支持。
3、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
4、利用高效液相色谱法分离多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，所述有关物质包括硫酸皮肤素；所述多磺酸粘多糖的结构式如式ⅰ所示，所述硫酸皮肤素的结构式如式ⅱ所示；所述高效液相色谱法的色谱柱采用强阴离子交换柱，保护柱采用强阴离子保护柱；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为磷酸盐溶液；流动相b为磷酸盐和高氯酸盐的混合溶液，所述流动相b中，磷酸盐和高氯酸盐的质量比为1：350；所述流动相采用磷酸调节ph为3.0；采用梯度洗脱依次将硫酸皮肤素和多磺酸粘多糖进行分离；
5、
6、
7、式ⅰ所示化合物中，r为so3na、h中的任一种。
8、进一步，待测样品包括多磺酸粘多糖原料药。
9、进一步，所述梯度洗脱程序如下：
10、在0-40分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为75：25，进行等度洗脱；
11、在40-45分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为75：50，进行线性梯度洗脱；
12、在45-60分钟，设置所述流动相a和所述流动相b的体积比为75：25，进行等度洗脱。
13、作为优选，所述流动相配制方法如下：
14、流动相a：将磷酸二氢钠二水合物溶解于纯化水中，用磷酸调节ph至3.0，用0.45μm的滤膜过滤并脱气，得到所述流动相a。
15、流动相b：将磷酸二氢钠二水合物和高氯酸钠一水合物溶解于纯化水中，用磷酸调节ph至3.0，用0.45μm的滤膜过滤并脱气，得到所述流动相b。
16、进一步，所述流动相流速为0.22ml/min，所述色谱柱柱箱温度为40℃。
17、进一步，进样量为20μl。
18、进一步，所述色谱柱优选as11-hc阴离子分析柱，规格为2*250mm；所述保护柱优选ag11-hc阴离子保护柱，规格为2*50mm。
19、本专利技术的目的之二在于提供一种定性鉴别多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，该方法可以鉴别多磺酸粘多糖中是否含有有关物质。
20、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
21、定性鉴别多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，利用前述分离方法分离多磺酸粘多糖及其有关物质；分离后，采用检测波长为222nm的检测器进行检测，并得到色谱图。
22、作为优选，检测器为紫外检测器。
23、进一步，根据待测样品与对照品色谱行为的一致性，判断多磺酸粘多糖待测样品中是否含有所述有关物质。
24、进一步，保留时间在25.5±0.5min的为所述硫酸皮肤素；保留时间在35.6±0.5min的为所述多磺酸粘多糖。
25、本专利技术的目的之三在于提供一种检测多磺酸粘多糖中有关物质的含量的方法，该方法可以在55分钟内或大于55分钟的时间实现多磺酸粘多糖中有关物质的含量检测，更利于多磺酸粘多糖制剂的质量控制。
26、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
27、检测多磺酸粘多糖中有关物质的含量的方法，包括如下步骤：
28、(1)分离：利用前述分离方法对多磺酸粘多糖及其有关物质进行分离；
29、(2)检测：利用前述鉴别方法检测多磺酸粘多糖及其有关物质，并得到色谱图；
30、(3)含量计算：根据步骤(2)得到的色谱图，利用峰面积计算各组分含量。
31、进一步，所述硫酸皮肤素在4.6μg/ml～184.0μg/ml浓度范围内，y＝20845x-24594，r2＝0.999；其中，x为横坐标，表示浓度；y为纵坐标，表示峰面积，r表示相关系数。
32、进一步，分离前，以去离子水为溶剂，配制待测样品和对照品溶液。
33、作为优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
34、(1)配制对照品溶液
35、对照品溶液(a)：精密称取多磺酸粘多糖参考标准品crs，如250mg，加入2.0ml纯化水，漩涡混匀。
36、对照品溶液(b)：先精密称取硫酸皮肤素标准品，如20mg，再精密称取多磺酸粘多糖标准品20mg，加入2.0ml纯化水溶解，漩涡混匀。
37、对照品溶液(c)：精密量取如1200μl对照品溶液(a)和300μl对照品溶液(b)到1.5ml离心管中，用混匀器混合均匀。
38、对照品溶液(d)：精密量取如100μl对照品溶液(c)于900μl纯化水中，用混匀器混合均匀。
39、对照品溶液(e)：精密量取如400μl对照品溶液(a)于100μl去纯化水中，用混匀器混合均匀，然后加入250μl的1m盐酸溶液和50μl浓度为250mg/ml的亚本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.利用高效液相色谱法分离多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，其特征在于，所述有关物质包括硫酸皮肤素；所述多磺酸粘多糖的结构式如式Ⅰ所示，所述硫酸皮肤素的结构式如式Ⅱ所示；所述高效液相色谱法的色谱柱采用强阴离子交换柱，保护柱采用强阴离子保护柱；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为磷酸盐溶液；流动相B为磷酸盐和高氯酸盐的混合溶液，所述流动相B中，磷酸盐和高氯酸盐的质量比为1：350；所述流动相采用磷酸调节pH为3.0；采用梯度洗脱依次将硫酸皮肤素和多磺酸粘多糖进行分离；
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，待测样品包括多磺酸粘多糖原料药。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流动相流速为0.22ml/min，所述色谱柱柱箱温度为40℃。
5.定性鉴别多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的方法分离多磺酸粘多糖及其有关物质；分离后，采用检测波长为222nm的检测器进行检测，并得到色谱图。
6.根据权利要求5所述的
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，保留时间在25.5±0.5min的为所述硫酸皮肤素；保留时间在35.6±0.5min的为所述多磺酸粘多糖。
8.检测多磺酸粘多糖中有关物质的含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述硫酸皮肤素在4.6μg/mL～184.0μg/mL浓度范围内，Y＝20845X-24594，R2＝0.999；其中，X为横坐标，表示浓度；Y为纵坐标，表示峰面积，R表示相关系数。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述有关物质含量计算公式如下：
...【技术特征摘要】
1.利用高效液相色谱法分离多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，其特征在于，所述有关物质包括硫酸皮肤素；所述多磺酸粘多糖的结构式如式ⅰ所示，所述硫酸皮肤素的结构式如式ⅱ所示；所述高效液相色谱法的色谱柱采用强阴离子交换柱，保护柱采用强阴离子保护柱；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为磷酸盐溶液；流动相b为磷酸盐和高氯酸盐的混合溶液，所述流动相b中，磷酸盐和高氯酸盐的质量比为1：350；所述流动相采用磷酸调节ph为3.0；采用梯度洗脱依次将硫酸皮肤素和多磺酸粘多糖进行分离；
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，待测样品包括多磺酸粘多糖原料药。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流动相流速为0.22ml/min，所述色谱柱柱箱温度为40℃。
5.定性鉴别多磺酸粘多糖及其有关物质的方法，其特征在于，利用权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹怀君，张岩岩，王飞，吕佳，张言琴，郑勇，
申请(专利权)人：重庆望业药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：
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