【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种红酵母可迭代基因编辑工具及其应用。
技术介绍
1、以圆红冬孢酵母(rhodotorula toruloides)为例的红酵母隶属于真菌界、担子菌门、微葡萄孢菌纲、锁掷酵母目、红酵母属，是一种性状优良的非常规酵母。其优良之处在于：(1)可以广泛利用不同底物来提供微生物生长所需的碳氮源，包括糖类(蔗糖、纤维二糖等)、农林废弃物资源(甘蔗渣水解物、玉米秸秆水解物等)、工业废水(淀粉废水、乙醇废水等)等；(2)可以合成多种代谢产物，包括油脂(油酸、硬脂酸等)、类胡萝卜素(β-胡萝卜素、红酵母红素等)、部分工业用酶(磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶等)等；(3)具有良好的鲁棒性，表现为耐受低ph、高渗透压、高温等极端条件。对红酵母基因组进行遗传改造是进一步提高其生产性能的必要手段，有助于扩展对其遗传基础和代谢途径的认识，并快速设计改造工程化目标。
2、crispr-cas9隶属于第二大类ⅱ型crispr-cas系统，是常用遗传改造技术，在红酵母中已有应用(jiao等，2019；otoupal等，2019；schultz等，2019)，但是利用crispr-cas9系统进行基因突变后的基因组会残留抗性筛选基因，由于该酵母自身可以直接利用的抗性筛选基因有限，因此限制了利用该系统进一步的改造其他相关基因。此外，由于红酵母的同源重组(homologous recombination)能力弱，因此利用该机制结合crispr-cas9系统介导基因整合的效率非常低。
3、cre-loxp隶属于酪氨酸
4、目前，本领域中仍然缺乏一种适用于红酵母的高效、精准、可迭代的基因编辑技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种快速高效可迭代的红酵母基因组编辑工具，从而解决现有的红酵母基因组编辑技术存在的无法迭代基因突变和基因整合的问题。
2、为了解决上述问题，本专利技术提出了以下技术方案：
3、根据本专利技术的第一方面，提供一种红酵母可迭代基因编辑工具，所述红酵母可迭代基因编辑工具由双质粒系统构成，包括表达crispr-cas系统和cre-loxp系统的辅助质粒1和表达grna和外源基因的辅助质粒2；所述辅助质粒1包含密码子优化的cre重组酶、密码子优化的spcas9蛋白、组成型启动子ppgk1、诱导型启动子pgal1、以及终止子thsp，其中cre重组酶为诱导型表达，spcas9蛋白为组成型表达；所述辅助质粒2包含loxp序列、grna表达框和外源基因，其中grna和外源基因为组成型表达。
4、虽然本说明书具体实施方式是以met14基因作为外源基因，但是应当理解的是，met14基因仅作为举例而非限制，这里的外源基因可以是任何外源基因。
5、根据本专利技术的一个优选方案，所述辅助质粒1包含如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述辅助质粒2包含如seq id no:2所示或如seq id no:3所示的核苷酸序列。
6、根据本专利技术的一个优选方案，所述辅助质粒1通过将seq id no:1所示序列插入到基础质粒nm9-spcas9-nls3中获得。
7、其中，seq id no:1包含启动子pgal1、来源于大肠杆菌噬菌体p1的重组酶cre的编码基因和终止子thsp。cre重组酶的诱导表达由半乳糖诱导型启动子pgal1诱导表达，由thsp终止子终止整个转录过程，具有启动子-cre重组酶基因序列-终止子结构。根据本专利技术的一个实施方案，辅助质粒1的构建过程为：利用引物对s1-f/s1-r(gtagttctgcagttgggtaccttggcgaggatggcggacgaggc/tgggcccggcgc gccgaattccgcgcacttctctgcactgcatct)扩增seqid no:1序列，然后将扩增产物通过一步法快速克隆试剂盒插入到基础质粒nm9-spcas9-nls3(addgene:plasmid#128177)的kpni和ecori酶切位点中，得到辅助质粒1。
8、loxp序列具有两个，且同向位于grna表达框和抗性筛选基因的两侧，具有(x)loxp-grna表达框-抗性筛选基因表达框-(x)loxp-外源基因表达框(可选)的结构，x代表34个特定碱基，可选表示看具体情况选择使用或不使用。根据本专利技术的一个优选方案，辅助质粒2结构：(x)loxp-grna表达框-抗性筛选基因表达框-(x)loxp-外源基因表达框(可选)，其选自于seq id no:2和seq id no:3。
9、根据本专利技术的一个优选方案，所述辅助质粒2包括：辅助质粒2-1和辅助质粒2-2，其中，辅助质粒2-1通过将seq id no:2序列与基础质粒nm1-5s-trna-sgh进行连接获得，所述辅助质粒2-2通过将seq id no:3所示序列与质粒nm1-5s-trna-sgh进行连接获得。
10、其中seq id no:2包含特定识别序列loxp、grna表达框、潮霉素抗性基因表达框hyg、特定识别序列loxp，按照loxp-grna表达框-hyg-loxp的顺序进行排列。根据本专利技术的一个实施方案，辅助质粒2-1的构建过程为：利用引物对s2-f/s2-r(tgcggacgtttttaatgtac/ccaagctcaagctaagcttg)扩增seq id no:2序列，然后将扩增产物与基础质粒nm1-5s-trna-sgh(addgene：plasmid#128178)的扩增产物(引物对5s-f/5s-r:caagcttagcttgagcttgg/gtacattaaaaacgtccgca)通过一步法快速克隆试剂盒进行连接，得到辅助质粒2-1。
11、其中seq id no:3包含特定识别序列loxp、潮霉素抗性基因表达框hyg、特定识别序列loxp、外源基因表达框，按照loxp-hyg-loxp-外源基因表达框的顺序进行排列。根据本专利技术的一个实施方案，辅助质粒2-2的构建过程为：利用引物对s2-f/s2-r扩增seq id no:3序列，然后将其与质粒nm1-5s-trna-sgh的扩增产物(引物对5s-f/5s-r)进行连接，得到辅助质粒2-2。
12、根据本专利技术的第二方面，提供一种基于crispr-cas9系统联合cre-loxp系统对红酵母基因组的可迭代基因编辑方法，包括以下步骤：
13、1)通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述红酵母可迭代基因编辑工具由双质粒系统构成，包括表达CRISPR-Cas系统和Cre-loxp系统的辅助质粒1和表达gRNA和外源基因的辅助质粒2；所述辅助质粒1包含密码子优化的Cre重组酶、密码子优化的SpCas9蛋白、组成型启动子PPGK1、诱导型启动子Pgal1、以及终止子Thsp，其中Cre重组酶为诱导型表达，SpCas9蛋白为组成型表达；所述辅助质粒2包含loxp序列、gRNA表达框和外源基因，其中gRNA和外源基因为组成型表达。
2.根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述辅助质粒1包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述辅助质粒2包含如SEQ ID NO:2所示或如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述辅助质粒1通过将SEQ ID NO:1所示序列插入到基础质粒NM9-SpCas9-NLS3中获得；所述辅助质粒2包括：辅助质粒2-1和辅助质粒2-2，其中，辅助质粒2-1通过将SEQ ID NO:2
4.一种根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具在基因组编辑中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述红酵母底盘细胞可以正常表达有活性的SpCas9蛋白和可以诱导表达有活性的Cre重组酶；所述辅助质粒2包括用于基因突变和用于外源基因整合的两种构建方式；所述验证手段是菌液PCR扩增；所述红酵母工程细胞可以迭代导入辅助质粒2用于不同用途的代谢途径改造。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述红酵母工程细胞可以迭代导入辅助质粒2用于以下两种用途的代谢途径改造：
7.一种根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具在红酵母基因组编辑中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备麦角硫因产品中的应用。
9.一种根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具在基因组编辑制备PAL基因缺失和Met14基因整合的红酵母中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备麦角硫因产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述红酵母可迭代基因编辑工具由双质粒系统构成，包括表达crispr-cas系统和cre-loxp系统的辅助质粒1和表达grna和外源基因的辅助质粒2；所述辅助质粒1包含密码子优化的cre重组酶、密码子优化的spcas9蛋白、组成型启动子ppgk1、诱导型启动子pgal1、以及终止子thsp，其中cre重组酶为诱导型表达，spcas9蛋白为组成型表达；所述辅助质粒2包含loxp序列、grna表达框和外源基因，其中grna和外源基因为组成型表达。
2.根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述辅助质粒1包含如seq id no:1所示的核苷酸序列，所述辅助质粒2包含如seq id no:2所示或如seq idno:3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的红酵母可迭代基因编辑工具，其特征在于，所述辅助质粒1通过将seq id no:1所示序列插入到基础质粒nm9-spcas9-nls3中获得；所述辅助质粒2包括：辅助质粒2-1和辅助质粒2-2，其中，辅助质粒2-1通过将seq id no:2序列与基础质粒nm1-5s-trna-sgh进行连接获得，所述辅助质粒2-...
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