【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及使用crispr/cas系统(识别并切割外源基因元件的原核免疫系统的一部分)进行基因编辑的领域。
技术介绍
1、原核crispr/cas系统依赖于具有rna和dna结合活性的核酸酶，或此类复合物的dna结合亚基，其中dna结合活性为序列特异性的并取决于rna的序列。通常被称为rna引导的dna结合剂的此类复合物包含多种rna引导的dna结合剂，包括cas裂解酶/切口酶。cas裂解酶和cas切口酶包括第iii型crispr系统的csm或cmr复合物、其cas10、csm1或cmr2亚基、第i型crispr系统的级联(cascade)复合物、其cas3亚基和第2类cas核酸酶。示例性单体核酸酶，诸如cas9(被称为crispr相关蛋白9(cas9))，诱导dna中的位点特异性断裂。引导rna通常通过体外寡核苷酸合成来制备。考虑到寡核苷酸合成的环状性质和不完全产率，用非核酸内部接头取代grna的部分同时保留或甚至提高其活性将为合乎需要的，例如使得grna可以更高产率获得(例如，归因于核苷酸添加的较少循环)，或使得包含grna的组合物具有较高同质性或较少不完全或不正确产物。另外，尤其对于治疗应用，需要用于防止此类降解、改善grna的稳定性并提高基因编辑效率的改善方法和组合物。
技术实现思路
1、在一些实施方案中，提供基因组编辑工具，其包含含有如本文所描述的内部接头的引导rna(grna)。本申请源自非核酸接头可置换引导rna中与cas核酸酶具有非必需接触的某些内部部分的发现。本文
2、在一些实施方案中，提供具有一个或多个取代以包含一个或多个如本文所描述的内部接头的单引导rna(sgrna)。
3、在一些实施方案中，提供具有一个或多个取代以包含一个或多个如本文所描述的内部接头的crisprrna(crrna)或tracrrna(trrna)。在一些实施方案中，修饰的crrna或修饰的trrna包含双引导rna(dgrna)。在一些实施方案中，修饰的crrna或修饰的trrna包含单引导rna(sgrna)。用一个或多个如本文所描述的内部接头进行取代可有助于以更高产率或均质性合成grna；或可改善grna和其对应核酸酶(例如grna/cas复合物，例如grna/cas9复合物)的稳定性并提高核酸酶(例如cas9核酸酶(例如saucas9、spycas9))的活性例如以使靶dna裂解或切口。与包含所有核苷酸的引导物，例如100聚体spy cas 9sgrna或其他短引导spy cas9 rna相比，本公开所公开的引导rna的合成可增加引导rna的粗产率。类似地，以全长产物的比例测量的grna样品纯度(例如粗纯度)可增加。grna可以较高产率获得，或包含grna的组合物可具有较高同质性或较少不完全或不正确产物。引导rna纯度可使用离子对反相高效液相色谱法(ip-rp-hplc)和离子交换hplc方法评定，例如与kanavarioti等人,sci rep 9,1019(2019)(doi:10.1038/s41598-018-37642-z)中相同。使用260nm波长下的uv光谱分析，可通过色谱图中主峰的吸收度与所有峰的累积吸光度的比率来测定粗纯度和最终纯度。合成产率是以最终样品在260nm下的吸光度与输入材料的理论吸光度的比率确定。
4、涵盖以下实施方案。
5、在一些实施方案中，提供一种引导rna(grna)，其包含内部接头。在一些实施方案中，内部接头取代grna的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头具有约3至30个、任选地12至21个原子的桥接长度，并且接头取代grna的至少2个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头具有约6至18个原子、任选地约6至12个原子的桥接长度，并且接头取代grna的至少2个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头取代2至12个核苷酸。
6、在一些实施方案中，内部接头位于grna的重复反重复区(repeat-anti-repeatregion)中。在一些实施方案中，内部接头取代grna的重复反重复区的至少4个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头取代grna的重复反重复区的多至28个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头取代grna的重复反重复区的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸。
7、在一些实施方案中，内部接头位于grna的发夹区中。在一些实施方案中，内部接头取代grna的发夹区的至少2个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头取代grna的发夹区的至多22个核苷酸。在一些实施方案中，内部接头取代grna的发夹区的1、2、3、4、5、6、7、8或9个碱基对。
8、在一些实施方案中，内部接头位于grna的连结点区(nexus region)中。在一些实施方案中，内部接头取代grna的连结点区的1或2个核苷酸。
9、在一些实施方案中，内部接头位于grna的第一部分与grna的第二部分之间的发夹中，其中所述第一部分和所述第二部分一起形成双链体部分。在一些实施方案中，内部接头桥接双链体的第一部分与双链体的第二部分，其中所述双链体包含2至10个碱基对。
10、在一些实施方案中，grna包含两个内部接头。在一些实施方案中，grna包含三个内部接头。
11、在一些实施方案中，提供一种单引导rna(sgrna)，所述sgrna包含引导区和所述引导区的3'的保守部分，其中所述保守部分包含重复反重复区、连结点区、发夹1区和发夹2区，并且包含以下中的至少一者：
12、1)第一内部接头，其取代所述重复反重复区的上茎区的至少2个核苷酸；
13、2)第二内部接头，其取代所述连结点区的1或2个核苷酸；和
14、3)第三内部接头，其取代所述发夹1的至少2个核苷酸。
15、在一些实施方案中，提供一种单引导rna(sgrna)，所述sgrna包含引导区和所述引导区的3'的保守部分，其中保守部分包含重复反重复区、发夹1区和发夹2区，并且还包含以下中的至少一者：
16、1)第一内部接头，其取代所述sgrna的所述重复反重复区的上茎区的至少2个核苷酸；
17、2)第二内部接头，其取代所述sgrna的所述发夹1的1或2个核苷酸；或
18、3)第三内部接头，其取代所述s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引导RNA(gRNA)，其包含内部接头。
2.如权利要求1所述的gRNA，其中所述内部接头具有约3至30个原子、任选地12至21个原子的桥接长度，并且所述接头取代所述gRNA的至少2个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的gRNA，其中所述内部接头具有约6至18个原子、任选地约6至12个原子的桥接长度，并且所述接头取代所述gRNA的至少2个核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头取代2至12个核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头位于所述gRNA的重复反重复区中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头取代所述gRNA的重复反重复区的至少4个核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头取代所述gRNA的重复反重复区的多至28个核苷酸。
8.如权利要求1至7中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头位于所述gRNA的发夹区中。
9.如权利要求1至8中任一项所述的gRNA，其中
10.如权利要求1至9中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头位于所述gRNA的第一部分与所述gRNA的第二部分之间的发夹中，其中所述第一部分和所述第二部分一起形成双链体部分。
11.如权利要求1至10中任一项所述的gRNA，其中所述重复反重复区中的内部接头位于所述重复反重复区的第一部分与第二部分之间的发夹中，其中所述第一部分和所述第二部分一起形成双链体部分。
12.如权利要求1至11中任一项所述的gRNA，其中所述内部接头取代所述gRNA的发夹。
13.如权利要求1至12中任一项所述的gRNA，其中所述gRNA为单引导RNA(sgRNA)。
14.一种引导RNA(gRNA)，其中所述gRNA为单引导RNA(sgRNA)，其包含引导区和所述引导区的3'的保守部分，其中所述保守部分包含重复反重复区、连结点区、发夹1区和发夹2区，并且包含以下中的至少一者：
15.如权利要求14所述的gRNA，其中所述第一内部接头具有约9至30个原子、任选地约15至21个原子的桥接长度。
16.如权利要求14或权利要求15所述的gRNA，其中所述第一内部接头取代所述上茎区的环或其部分。
17.如权利要求14至16中任一项所述的gRNA，其中所述第一内部接头取代所述上茎区的所述环和茎，或其部分。
18.如权利要求14至17中任一项所述的gRNA，其中所述第一内部接头取代构成所述上茎区的所述环的所有核苷酸。
19.如权利要求14至18中任一项所述的gRNA，其中所述第一内部接头取代构成所述上茎区的所述环和茎的所有核苷酸。
20.如权利要求14至19中任一项所述的gRNA，其中所述第二内部接头具有约6至18个原子、任选地约6至12个原子的桥接长度。
21.如权利要求14至20中任一项所述的gRNA，其中所述第三内部接头具有约9至30个、任选地约12至21个原子的桥接长度。
22.如权利要求14至21中任一项所述的gRNA，其中所述第三内部接头取代所述发夹1的环或其部分。
23.如权利要求14至21中任一项所述的gRNA，其中所述第三内部接头取代所述发夹1的所述环和茎或其部分。
24.如权利要求14至23中任一项所述的gRNA，其中所述第三内部接头取代构成所述发夹1的所述环的所有核苷酸。
25.如权利要求14至23中任一项所述的gRNA，其中所述第三内部接头取代构成所述发夹1的所述环和茎的所有核苷酸。
26.如权利要求14至25中任一项所述的gRNA，其中所述sgRNA的所述发夹2区不含有任何内部接头。
27.如权利要求14至26中任一项所述的gRNA，其中所述sgRNA为化脓链球菌Cas9sgRNA。
28.如权利要求14至27中任一项所述的gRNA，其中所述sgRNA包含含有SEQ ID NO:400的序列的保守部分。
29.如权利要求28所述的gRNA，其中
30.如权利要求28或29所述的gRNA，
31.如权利要求28至30中任一项所述的gRNA，其中相对于SEQ ID NO:400，核苷酸77至80缺失。
32.如权利要求14至27中任一项所述的gRNA，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:201的序列。
33.如权利要求32所述的...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种引导rna(grna)，其包含内部接头。
2.如权利要求1所述的grna，其中所述内部接头具有约3至30个原子、任选地12至21个原子的桥接长度，并且所述接头取代所述grna的至少2个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的grna，其中所述内部接头具有约6至18个原子、任选地约6至12个原子的桥接长度，并且所述接头取代所述grna的至少2个核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的grna，其中所述内部接头取代2至12个核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的grna，其中所述内部接头位于所述grna的重复反重复区中。
6.如权利要求1至5中任一项所述的grna，其中所述内部接头取代所述grna的重复反重复区的至少4个核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的grna，其中所述内部接头取代所述grna的重复反重复区的多至28个核苷酸。
8.如权利要求1至7中任一项所述的grna，其中所述内部接头位于所述grna的发夹区中。
9.如权利要求1至8中任一项所述的grna，其中所述内部接头位于所述grna的连结点区中。
10.如权利要求1至9中任一项所述的grna，其中所述内部接头位于所述grna的第一部分与所述grna的第二部分之间的发夹中，其中所述第一部分和所述第二部分一起形成双链体部分。
11.如权利要求1至10中任一项所述的grna，其中所述重复反重复区中的内部接头位于所述重复反重复区的第一部分与第二部分之间的发夹中，其中所述第一部分和所述第二部分一起形成双链体部分。
12.如权利要求1至11中任一项所述的grna，其中所述内部接头取代所述grna的发夹。
13.如权利要求1至12中任一项所述的grna，其中所述grna为单引导rna(sgrna)。
14.一种引导rna(grna)，其中所述grna为单引导rna(sgrna)，其包含引导区和所述引导区的3'的保守部分，其中所述保守部分包含重复反重复区、连结点区、发夹1区和发夹2区，并且包含以下中的至少一者：
15.如权利要求14所述的grna，其中所述第一内部接头具有约9至30个原子、任选地约15至21个原子的桥接长度。
16.如权利要求14或权利要求15所述的grna，其中所述第一内部接头取代所述上茎区的环或其部分。
17.如权利要求14至16中任一项所述的grna，其中所述第一内部接头取代所述上茎区的所述环和茎，或其部分。
18.如权利要求14至17中任一项所述的grna，其中所述第一内部接头取代构成所述上茎区的所述环的所有核苷酸。
19.如权利要求14至18中任一项所述的grna，其中所述第一内部接头取代构成所述上茎区的所述环和茎的所有核苷酸。
20.如权利要求14至19中任一项所述的grna，其中所述第二内部接头具有约6至18个原子、任选地约6至12个原子的桥接长度。
21.如权利要求14至20中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头具有约9至30个、任选地约12至21个原子的桥接长度。
22.如权利要求14至21中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代所述发夹1的环或其部分。
23.如权利要求14至21中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代所述发夹1的所述环和茎或其部分。
24.如权利要求14至23中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代构成所述发夹1的所述环的所有核苷酸。
25.如权利要求14至23中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代构成所述发夹1的所述环和茎的所有核苷酸。
26.如权利要求14至25中任一项所述的grna，其中所述sgrna的所述发夹2区不含有任何内部接头。
27.如权利要求14至26中任一项所述的grna，其中所述sgrna为化脓链球菌cas9sgrna。
28.如权利要求14至27中任一项所述的grna，其中所述sgrna包含含有seq id no:400的序列的保守部分。
29.如权利要求28所述的grna，其中
30.如权利要求28或29所述的grna，
31.如权利要求28至30中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:400，核苷酸77至80缺失。
32.如权利要求14至27中任一项所述的grna，其中所述sgrna包含seq id no:201的序列。
33.如权利要求32所述的grna，其中
34.如权利要求32或33所述的grna，其中
35.如权利要求32至34中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:201，核苷酸77至80缺失。
36.如权利要求1所述的grna，其中所述内部接头为第一内部接头、第二内部接头或第三内部接头；并且所述grna包含引导区和保守区，所述保守区包含以下中的一者或多者：
37.一种引导rna(grna)，其包含引导区和保守区，所述保守区包含以下中的一者或多者：
38.如权利要求36或权利要求37所述的grna，其中至少10个核苷酸为修饰的核苷酸。
39.如权利要求36至38中任一项所述的grna，其中所述引导区具有(i)相对于seq idno:500，位置1至24内一个核苷酸的插入或1至4个核苷酸的缺失；或(ii)24个核苷酸的长度。
40.如权利要求36至39中任一项所述的grna，其中所述引导区具有23或24个核苷酸的长度，在seq id no:500的位置1至24。
41.如权利要求36至40中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:500，核苷酸144和145中的一者或多者缺失。
42.如权利要求36至41中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:500，核苷酸144和145均缺失。
43.如权利要求36至42中任一项所述的grna，其中所述缩短的重复/反重复区缺乏2至28个核苷酸。
44.如权利要求36至43中任一项所述的grna，其中所述缩短的重复/反重复区缺乏12至28个、任选地18至24个核苷酸。
45.如权利要求36至44中任一项所述的grna，其中seq id no:500的核苷酸37至64形成上茎，并且所述缩短的重复/反重复区的上茎的一个或多个碱基对缺失。
46.如权利要求36至45中任一项所述的grna，其中所述缩短的重复/反重复区的上茎包含不超过一个、两个、三个或四个碱基对。
47.如权利要求36至46中任一项所述的grna，其中所述缩短的重复/反重复区具有长度为11个碱基配对核苷酸的双链体部分。
48.如权利要求36至47中任一项所述的grna，其中所述缩短的重复/反重复区具有单一双链体部分。
49.如权利要求36至48中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:500，所述缩短的重复/反重复区的上茎包含一个或多个取代。
50.如权利要求36至49中任一项所述的grna，其中所述第一内部接头取代核苷酸49至52中的至少一部分或全部。
51.如权利要求36至50中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区具有长度为4至8个、任选地7至8个碱基配对核苷酸的双链体部分。
52.如权利要求36至51中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区具有单一双链体部分。
53.如权利要求36至52中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区的一个或两个碱基对缺失。
54.如权利要求36至53中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区的茎的长度为七个或八个碱基配对核苷酸。
55.如权利要求36至54中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区的位置85至86中的一者或多者和核苷酸91至92中的一者或多者缺失。
56.如权利要求36至55中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:500，所述缩短的发夹1区的核苷酸82至95中的一者或多者被取代。
57.如权利要求36至56中任一项所述的grna，其中所述第二内部接头取代核苷酸87至90中的至少一部分或全部。
58.如权利要求36至56中任一项所述的grna，其中所述第二内部接头取代核苷酸81至95中的至少一部分或全部。
59.如权利要求36至58中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹1区具有2至15个修饰的核苷酸。
60.如权利要求36至59中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区缺乏2至18个、任选地2至16个核苷酸。
61.如权利要求36至60中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区的位置113至121中的一者或多者和核苷酸126至134中的一者或多者缺失。
62.如权利要求36至61中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区包含不成对区。
63.如权利要求36至62中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区具有两个双链体部分。
64.如权利要求63所述的grna，其中所述缩短的发夹2区具有长度为4个碱基配对核苷酸的双链体部分。
65.如权利要求63或64所述的grna，其中所述缩短的发夹2区具有长度为4至8个碱基配对核苷酸的双链体部分。
66.如权利要求63至65中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区具有长度为4至6个碱基配对核苷酸的双链体部分。
67.如权利要求36至66中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区的上茎包含一个、两个、三个或四个碱基对。
68.如权利要求36至67中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区的位置113至121和126至134全部缺失。
69.如权利要求36至68中任一项所述的grna，其中相对于seq id no:500，所述缩短的发夹2区的核苷酸113至134中的一者或多者被取代。
70.如权利要求36至69中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代核苷酸122至125中的至少一部分或全部。
71.如权利要求36至70中任一项所述的grna，其中所述第三内部接头取代核苷酸112至135中的至少一部分或全部。
72.如权利要求36至71中任一项所述的grna，其中所述缩短的发夹2区具有2至15个修饰的核苷酸。
73.如权利要求1至72中任一项所述的grna，其中所述grna的引导区包含至少两个修饰的核苷酸、任选地至少四个修饰的核苷酸。
74.如权利要求1至73中任一项所述的grna，
75.如权利要求1至74中任一项所述的grna，
76.如权利要求74至75中任一项所述的grna，其中所述重复/反重复区、所述发夹1区或所述发夹2区中的修饰包含选自以下的修饰的核苷酸：2'-o-甲基(2'-ome)修饰的核苷酸和核苷酸间的硫代磷酸酯(ps)键联或其组合。
77.如权利要求1至76中任一项所述的grna，其中所述引导区的核苷酸1至3是修饰的，并且所述引导区中核苷酸1至3以外的核苷酸是未修饰的。
78.一种单引导rna(sgrna)，其包含如表4a中所示的seq id no:1001-1012或任何其他序列中的任一者。
79.如权利要求1至78中任一项所述的grna，其包含与如表4a中所示的seq id no:1001-1012或任何其他序列中任一者的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％或70％同一性的核苷酸序列。
80.如权利要求1至79中任一项所述的grna，其包含与如表4a至4b中所示的seq id no:1001-1002和710-759中任一者的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％或70％同一性的核苷酸序列，其中与表4a中的参考序列标识符的核苷酸对应的所述grna的各核苷酸的修饰与表4b中的参考序列标识符中所示的修饰相同或等同。
81.如权利要求1至80中任一项所述的grna，其包含与如表4a至4b中所示的seq id no:1001-1002和710-759中任一者的核苷酸序列的x至3'端的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的核苷酸序列，其中x为保守区的第一个核苷酸。
82.如权利要求1至42和44至81中任一项所述的grna，其还包含含有2'-o-me修饰的核苷酸的3'尾。
83.如权利要求1至82中任一项所述的grna，其中所述grna将核酸酶引导至靶序列以进行结合。
84.如权利要求1至83中任一项所述的grna，其中所述grna将核酸酶引导至靶序列以诱导所述靶序列内双链断裂。
85.如权利要求1至84中任一项所述的grna，其中所述grna将核酸酶引导至靶序列以诱导所述靶序列内单链断裂。
86.如权利要求82至84中任一项所述的grna，其中所述核酸酶为nmecas9。
87.如权利要求86所述的grna，其中所述nme cas9为nme1cas9、nme2 cas9或nme3cas9。
88.如权利要求1至87中任一项所述的grna，其中所述grna包含保守取代，例如以保持碱基配对。
【专利技术属性】
技术研发人员：S·穆勒帕蒂，R·G·帕尔马，L·J·斯特雷茨，M·杨，J·J·博南诺，S·C·亚历山大，
申请(专利权)人：因特利亚治疗公司，
类型：发明
国别省市：
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