【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及基于根癌农杆菌外膜蛋白atuporin构建的细胞表面展示系统及其应用。
技术介绍
1、微生物细胞表面展示技术是指借助膜定位多肽片段(或者蛋白结构域)将目标序列以融合蛋白形式展示在微生物细胞表面的新型基因工程技术，具体介绍，是一种借助锚定蛋白将靶蛋白或多肽固定在细胞表面的技术，被展示的靶蛋白或多肽通常保持较为独立的空间构造和生物学活性。微生物细胞表面展示系统主要包括宿主菌、锚定蛋白和靶蛋白/多肽，一般在锚定蛋白和靶蛋白/多肽之间添加一段无显著生物学功能的接头(linker)序列，以保正靶蛋白/多肽正常发挥功能。微生物细胞表面展示系统在多肽筛选鉴定、酶类全细胞催化剂、全细胞吸附剂、疫苗和抗体筛选及生产、蛋白质互作文库筛选、生物传感器、生态环境修复等方面具有非常广阔的应用前景1，2，3。
2、2018年诺贝尔化学奖授予专利技术噬菌体展示技术的科学家。发展到现在，目前在微生物细胞表面展示系统中应用较为普遍的主要有噬菌体(bacterionphages)、革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌escherichia coil)、革兰氏阳性细菌(如谷氨酸杆菌corynebacteriumglutamicum；枯草芽孢杆菌bacillus subtilis等)、酵母菌(如酿酒酵母saccharomycescerevisiae)等。微生物细胞表面展示系统中关键的锚定蛋白一般具有以下特性：(1)可以稳定的表达固定在细胞表面；(2)能够与靶蛋白/多肽进行有效的融合且不影响靶蛋白/多肽的结构和生物学功能；(3)能够抵抗培养
3、根癌农杆菌是危害作物最为严重的植物病原菌之一，可以诱发宿主形成冠瘿瘤6。在自然界中，这种土传性的细菌性病害严重影响作物的产量和品质。同时由于根癌农杆菌具有强大的转移基因的能力，因此也被科研人员开发广泛应用于植物的遗传转化。目前，尚无报道关于根癌农杆菌的细胞表面展示系统。鉴于此，开发一种高效的根癌农杆菌细胞表面展示系统至关重要，以便快速筛选和鉴定能抑制病原细菌的多肽。这一技术不仅有助于开发绿色环保的植物病害防治技术，还能为抗病育种提供宝贵的基因资源。
4、参考文献：
5、1、chen,t.,et al.2019construction of a bacterial surface displaysystem based on outer membrane protein f.microb cell fact 18(1):70.
6、2、park,m.2020surface display technology for biosensor applications:areview.sensors(basel)20(10).
7、3、anand,t.,et al.2021phage display technique as a tool for diagnosisand antibody selection for coronaviruses.curr microbiol 78(4):1124-1134.
8、4、付玮,李友国,李一星.2014基于黄单胞菌冰核蛋白n端的表面展示体系建立.chin j appl environ biol 20(3):351-356.
9、5、谢志丹,et al.2014枯草芽胞杆菌芽胞表面展示研究进展.chinabiotechnology34(8):105-111.
10、6、mansfield,j.,et al.2012top 10plant pathogenic bacteria in molecularplant pathology.mol plant pathol 13(6):614-29.
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供基于根癌农杆菌外膜蛋白atuporin构建的细胞表面展示系统及其应用，以解决现有技术的不足。
2、本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了根癌农杆菌外膜蛋白atuporin作为锚定蛋白在构建细胞表面展示系统中的应用，所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的氨基酸序列如seq id no:1所示。
4、进一步地，根癌农杆菌外膜蛋白atuporin作为锚定蛋白，其c端缺失11个氨基酸。
5、进一步地，所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的基因序列如seq id no:2所示。
6、进一步地，所述细胞表面展示系统是以根癌农杆菌外膜蛋白atuporin为锚定蛋白，将靶蛋白/多肽固定在根癌农杆菌细胞表面构成的根癌农杆菌细胞表面展示系统。
7、更进一步地，所述靶蛋白/多肽包括抗菌肽。
8、本专利技术第二方面提供了一种根癌农杆菌细胞表面展示系统，是以根癌农杆菌外膜蛋白atuporin为锚定蛋白，将靶蛋白/多肽固定在根癌农杆菌细胞表面构成的；所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的氨基酸序列如seq id no:1所示。
9、进一步地，根癌农杆菌外膜蛋白atuporin作为锚定蛋白，其c端缺失11个氨基酸。
10、进一步地，所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的基因序列如seq id no:2所示。
11、进一步地，所述靶蛋白/多肽包括抗菌肽。
12、本专利技术第三方面提供了上述根癌农杆菌细胞表面展示系统在鉴定靶蛋白/多肽毒性中的应用。
13、本专利技术的有益效果：
14、本专利技术首次克隆获得一个根癌农杆菌来源的外膜蛋白atuporin，经过分析和实验验证该蛋白定位在根癌农杆菌细胞外膜，将其c端缺失11个氨基酸，作为锚定蛋白构建细胞表面展示系统，填补了植物病原细菌缺乏有效细胞表面展示系统的空白。该细胞表面展示系统是一种非常高效的根癌农杆菌细胞表面展示系统，可以有效地将靶蛋白/多肽展示到根癌农杆菌细胞表面，经过iptg诱导蛋白/多肽表达后能够区分毒性蛋白/多肽和无毒性蛋白/多肽，具有鉴定外源靶蛋白/多肽毒性的能力，为针对性筛选对植物病原细菌有抑菌活性的抗菌肽搭建了有效的平台，应用该细胞表面展示系统有望筛选到新型高效的抗菌肽，为研究肽功能、开发绿色生物农药或抗病遗传育种开辟了新的思路，具有广阔的应用前景。
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1.根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin作为锚定蛋白在构建细胞表面展示系统中的应用，其特征在于，所述根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin作为锚定蛋白，其C端缺失11个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述细胞表面展示系统是以根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin为锚定蛋白，将靶蛋白/多肽固定在根癌农杆菌细胞表面构成的根癌农杆菌细胞表面展示系统。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白/多肽包括抗菌肽。
6.一种根癌农杆菌细胞表面展示系统，其特征在于，是以根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin为锚定蛋白，将靶蛋白/多肽固定在根癌农杆菌细胞表面构成的；所述根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求
8.根据权利要求6或7所述的一种根癌农杆菌细胞表面展示系统，其特征在于，所述根癌农杆菌外膜蛋白Atuporin的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
9.根据权利要求6或7所述的一种根癌农杆菌细胞表面展示系统，其特征在于，所述靶蛋白/多肽包括抗菌肽。
10.权利要求6-9任一权利要求所述的根癌农杆菌细胞表面展示系统在鉴定靶蛋白/多肽毒性中的应用。
...【技术特征摘要】
1.根癌农杆菌外膜蛋白atuporin作为锚定蛋白在构建细胞表面展示系统中的应用，其特征在于，所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，根癌农杆菌外膜蛋白atuporin作为锚定蛋白，其c端缺失11个氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述根癌农杆菌外膜蛋白atuporin的基因序列如seq id no:2所示。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述细胞表面展示系统是以根癌农杆菌外膜蛋白atuporin为锚定蛋白，将靶蛋白/多肽固定在根癌农杆菌细胞表面构成的根癌农杆菌细胞表面展示系统。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述靶蛋白/多肽包括抗菌肽。
6.一种根癌农...
【专利技术属性】
技术研发人员：焦晨，李晨浩，谢边悦，张超凡，黄江南，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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