【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的组合物及其应用。
技术介绍
1、软组织肉瘤是指来源于非上皮性骨外组织的一组恶性肿瘤。软组织肉瘤主要来源于中胚层，部分来源于神经外胚层，主要包括肌肉、脂肪、纤维组织、血管及外周神经。软组织肉瘤占人类所有恶性肿瘤的0.72％-1.05％，我国年发病率约为2.91/10万。我国男女发病患者数比例接近1：1。
2、软组织肉瘤诊断的金标准是组织病理学诊断，然而该病亚型众多，且多种良性与恶性肿瘤之间以及不同的肉瘤亚型之间存在相似的形态学，这给诊断带来了困难。近年来，软组织肿瘤的分子遗传学发展十分迅速，不仅在临床病理诊断中起着非常重要的作用，而且在协助临床制定治疗策略和预测生物学行为等方面也具有重要价值。随着新的分子检测手段的开展和应用，基于特定基因异常的新病种也在不断涌现，以往一些分化不明或未分化的肿瘤经过分子检测也得到了重新认识，软组织肿瘤分类的基础正在从形态学分类转向分子分类。本试剂盒对软组织肿瘤患者进行多基因联合检测，检测结果仅供临床参考，不应作为患者诊断和个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。
3、多基因的联合检测可进一步提高诊断和预测预后的准确性。然而，目前大多数试剂盒每次只能检测一种或几种基因融合，检测通量低，耗时长，对样本需求量大。虽然目前市面上用于科研用途的ngs panel也有可能一次性检测多种基因，但ngs价格昂贵、操作繁琐、数据分析复杂等因素也制约了ngs方
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的组合物，所述组合物包括引物和探针，所述引物和探针的序列如seq id no.1-157所示，所述引物和探针可用于检测32对融合基因，上述引物和探针用1条pcr 12联管分组分装(参见表1)。
2、表1引物和探针及其分配方式
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8、表232对肉瘤融合基因与肉瘤的对应提示关系
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11、本专利技术还提供了上述引物和探针的反应体系，包括：
12、(1)逆转录反应体系：纯化水0～5μl、10x逆转录缓冲液3～4μl、各引物0.05～0.15μm、逆转录酶100～200u，rna模板添加量20～30μl，总体积为30～40μl；
13、(2)pcr反应体系：纯化水10～20μl、5xpcr缓冲液6～10μl、mgc121～l0mm、各对引物0.1～0.2μm、各对探针0.05～0.15μm、dntps 0.2～0.3mm、taq酶1～10u，cdna模板的添加量为1～10μl，总体积为30～50μl。
14、本专利技术还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括seq id no：l～157序列，具体地，该试剂盒包括1种pcr 12联管，检测肉瘤rna基因融合，该试剂盒包含32对融合基因的特异性引物和特异探针，还包括pcr缓冲液、ung酶等。
15、检测一个样本需要1个pcr 12联管。1～4和6～10号管融合基因检测试剂分别由fam和rox信号指示，5、11、12号管融合基因检测试由fam信号指示，1～12号管的内控检测试剂用于监控样本rna质量及加入情况，由vic信号指示。
16、试剂盒组成详见表3、表4和表5。
17、表3试剂盒组成
18、 试剂盒组分 主要组成成分 数量/装量 12联反应条 引物、探针、buffer 35μl/孔×8条 混合酶 dna聚合酶、ung酶 45μl/管×1管 逆转录液 引物、buffer 70μl/管×1管 逆转录酶 逆转录酶 35μl/管×1管 阳性对照 质粒dna、野生型dna 150μl/管×1管
19、表4 pcr 12联管组成成分
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21、表5检测位点
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25、本专利技术还提供了上述试剂盒的使用方法，其步骤包括：
26、(1)提取检测样本中的rna，该检测样本包括石蜡包埋组织或石蜡切片组织；
27、(2)将上述rna与逆转录酶混合，加入逆转录反应液，得到cdna；
28、(3)将上述cdna分别与混合酶混合，并加入到pcr 12联管；
29、(4)经荧光pcr扩增仪扩增后，根据显示的ct值判断检测结果。
30、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
31、1.本专利技术采用特异性引物和探针技术，三色荧光通道检测模式，建立了实时pcr体系，可以同时检测32对融合基因，共有110种基因融合(详见表5)。
32、2.本专利技术根据所检测的多个融合位点的检测难易程度、引物之间的相互影响、竞争等多方面综合因素，将157条序列(包括引物和探针)分组，分装于1个pcr 12联管中，其优点在于：(1)采用多重pcr，将多种融合类型并管，并用不同荧光标记的探针加以区分，可以实现在一管内检测多种融合类型，便于客户操作，同时节约了检测成本及检测样本；(2)在融合类型并管时，除了考虑技术上并管的难度，还兼顾不同癌种的需求。对于同一种癌种，尽量放置于同一个反应管中，或放置于不同反应管的同一荧光通道，便于结果分析；(3)试剂盒可一次性检测110种融合位点，且各反应管的操作方法/扩增程序一致，操作简便，节约时间，便于临床应用；(4)每个反应体系中还含有内控检测体系，用于质控rna样本的质量及操作、仪器是否异常；(5)灵敏度高，对25拷贝/μl的融合基因质粒dna均可以检出；(6)检测时间短，检测过程只需要3个小时即可完成；⑺预分装设计，并进行密封处理，提高本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物和探针，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO.1-157所示。
2.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的探针和引物。
3.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1中所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、UNG酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有1个PCR12联管，其中1～4和6～10号管融合基因检测试剂分别由FAM和ROX信号指示，5、11、12号管融合基因检测试由FAM信号指示。
6.权利要求1所述的引物和探针在制备检测肉瘤多重基因融合产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
9.权利要求2所述的试剂在制备检测肉瘤多重基因融合产品中
...【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物和探针，所述引物和探针的序列如seq id no.1-157所示。
2.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的探针和引物。
3.一种用于同时检测肉瘤多重基因融合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1中所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr缓冲液、ung酶。
5.根据权利要求4...
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