【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵，具体涉及一种提高质粒产量的发酵方法。
技术介绍
1、目前，市场上大量利用单克隆筛选高产质粒的大肠杆菌，使用控制补料速率的策略维持低生长速率等方法，经过高密度和长时间培养后收获菌体，对菌体进行裂解，以及质粒的纯化，尽管产量较高，但其很难适用dna序列超过10kb大小，或gc含量(鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)较高的质粒，且宿主蛋白、宿主dna等一些宿主菌自身产物的在后续层析纯化过程中很难去除，最终会影响终产品质粒dna的质量，不能满足cgt(细胞基因治疗)领域一些高质量标准要求的质粒。
2、行业内的公司大部分发酵工艺中，初始培养基会加入抗生素，以及微量元素来提升质粒的发酵产量；或者补料培养基中的c源是由葡萄糖提供。在基因与细胞治疗领域中，添加抗生素，在质粒质量标准的质控项目中，cde会要求增加抗生素残留检测指标。而添加微量元素，其中含有重金属如钴等，可能也会有残留的风险，引起额外的检测难题和成本投入。葡萄糖作为最广泛的速效糖源，但要注意过多的葡萄糖会引起葡萄糖效应，即底物阻遏效应，因为葡萄糖过量或通气不足的情况下，大量积累丙酮酸、乳酸和乙酸等，所导致的ph下降，使自身的酶系活性下降，从而影响微生物代谢及质粒dna合成水平。缺陷是微量元素和抗生素添加，需检测其残留，增加成本投入和危害风险；葡萄糖易导致生长过快，质粒产量不高。
3、综上，现有的质粒dna生产工艺生产中，仍面临质粒dna产品质量不够好，以及工艺方法无法满足多品种化和规模化的生产要求。因此有必要进行工艺方法的开发及优化，提升质
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术目的在于提供一种提高质粒产量的发酵方法，可以大幅度的提高质粒的发酵产量，且工艺稳定，适用范围广，制备的质粒dna产品质量高。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种提高质粒产量的发酵方法，包括以下步骤：
3、(1)配制好基础发酵培养基和补料培养基，将基础发酵培养基高压蒸汽灭菌；
4、(2)冷却后，将制备好的种子液按照≥4v/v％比例接种至基础发酵培养基中，开始发酵，得发酵菌液；
5、(3)分批补料设置：
6、从发酵零点开始，发酵菌液培养至6h时，开始使用补料培养基按照0.16-0.20ml/min流加，控制比生长速率≤0.06，补料培养持续至16h；
7、16h后将补料培养基流加的速率调至0.24-0.30ml/min，限制比生长速率≤0.08，补料培养持续至22h；
8、22h后补料培养基流加的速率调至0.40-0.50ml/min，限制比生长速率≤0.1，补料培养持续至28h；
9、28h后补料培养基流加的速率调至0.56-0.70ml/min，限制比生长速率≤0.1，补料培养持续至40-48h发酵结束。
10、进一步地，所述基础发酵培养基配方：
11、大豆蛋白胨10-20g/l；
12、酵母抽提取物5-10g/l；
13、甘油6-12g/l；
14、磷酸二氢钾3.5-7.0g/l；
15、磷酸氢二钾9-18g/l；
16、硫酸镁0.5-0.8g/l；
17、硫酸铵4-6g/l；
18、消泡剂0.1-0.2g/l；
19、水；
20、进一步地，所述补料培养基配方：
21、大豆蛋白胨50-100g/l；
22、酵母抽提取物25-50g/l；
23、甘油150-300g/l；
24、葡萄糖25-50g/l；
25、水；
26、进一步地，所述基础发酵培养基与补料培养基的体积比为2.5:1。
27、进一步地，所述步骤(1)高压蒸汽灭菌温度≥121℃，灭菌时间为≥30min。
28、进一步地，所述种子液的制备方法：取甘油菌，按照≥1v/v％接种至种子液培养基中，培养温度为≥30℃，200-250rpm培养5-8h，5h后检测od600值，直至od600值达到2.0后停止培养，放2-8℃备用。
29、更进一步地，所述种子液培养基为lb培养基，所述培养温度为≥37℃。
30、进一步地，所述步骤(2)开始发酵的参数设置：发酵温度控制设为37℃；空气通入量为≥2vvm；ph值为6-8；溶氧设定为40±10％，初始转速设定200rpm，最高转速设置为1000rpm，与溶氧do级联。
31、本专利技术中：
32、本专利技术中发酵方法通过前期低温发酵条件，控制较低的生长速率，保持质粒dna的稳定复制。随着发酵时间的增加，积累一定的菌体数量，开始通过补料控制其比生长速率，主要控制策略是通过碳源与氮源的比例，以及补料时机，使其后期的高密度发酵过程，稳定生长的同时，保证了质粒dna的大量复制积累。
33、补料培养基的配方：碳源与氮源比例，合理的营养比例能保持质粒拷贝数的稳定复制，达到提高质粒产量的效果。
34、补料时机，包括补料时间和补料速度等参数，发酵过程中，作为主要营养物质碳源的甘油既可以提供碳源营养物质，也能抑制微生物的生长速率。补料过程中，随着甘油补加量的增加，可以合理的限制微生物的比生长速率，使其营养物质碳源的吸收与抑制微生物的生长达到平衡，保持酸性物质的低代谢速率，从而提高质粒的产量。
35、根据菌体的比生长速率，及时补加营养物质和所需营养物质的需求量，如前期发酵16小时控制甘油的添加量为：1.92g/h,随着发酵菌体密度的增加，甘油添加量呈线性递增，发酵至32小时后保持稳定在6.72g/h的添加量。
36、本专利技术的有益效果：
37、1.从本专利技术培养基成分可以看出，该配方简单，无需复杂的成分添加，同时也无动物源成分、抗生素成分和微量元素的添加，可以大幅度的提高质粒的发酵产量。
38、2.本专利技术通过合理的控制补料培养基的碳源与氮源比例，补料速度和补料时机等参数，大幅度提升质粒产量。
39、3.本专利技术提供的发酵方法提升不同序列质粒的适用性，涵盖了4.0-12.0kb大小范围的质粒dna。
40、4.本专利技术制备的质粒产品满足工业化生产需求，纯化后质粒质量标准可达cgt领域的应用标准。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述基础发酵培养基配方：
3.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基配方：
4.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述基础发酵培养基与补料培养基的体积比为2.5:1。
5.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)高压蒸汽灭菌温度≥121℃，灭菌时间为≥30min。
6.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述种子液的制备方法：取甘油菌，按照≥1v/v％接种至种子液培养基中，培养温度为≥30℃，200-250rpm培养5-8h，5h后检测OD600值，直至OD600值达到2.0后停止培养，放2-8℃备用。
7.根据权利要求6所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述种子液培养基为LB培养基，所述培养温度为≥37℃。
8.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，
...【技术特征摘要】
1.一种提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述基础发酵培养基配方：
3.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述补料培养基配方：
4.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述基础发酵培养基与补料培养基的体积比为2.5:1。
5.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)高压蒸汽灭菌温度≥121℃，灭菌时间为≥30min。
6.根据权利要求1所述的提高质粒产量的发酵方...
【专利技术属性】
技术研发人员：石先灯，曲和之，朱后顺，钱丹，唐祥武，
申请(专利权)人：广东三生制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。