【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人脑胶质瘤的类器官的构建方法，属于生物医学。
技术介绍
1、脑胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤之一，年发病率约为3-6.4/10万，其中胶质母细胞瘤患者平均生存期不超过一年，且目前尚没有有效的药物进行治疗。患者只能选择在复发后进行开颅手术减轻肿瘤负荷。此外，目前脑胶质瘤尚无明确的基因治疗靶点，即使通过基因检测也难以确定精准靶点治疗方案。脑胶质瘤患者亟需新的治疗药物或者治疗手段；而开发用于筛选脑胶质瘤的治疗药物或治疗方法的医学研究模型势在必行。
2、一直以来，在生物医学研究领域，小鼠模型是最重要的动物模型，这主要是由于小鼠的基因与人类基因具有高度同源性，且小鼠易饲养和繁殖，也可以对其进行基因工程和细胞工程的改造。然而，即使小鼠动物模型有诸多优势，依然存在建模流程复杂、建模时间长、与人类体内环境存在偏差、建模成本高昂等诸多缺点。特别是，人与啮齿动物大脑之间的明显的形态和生理差异限制了脑癌的动物模型的开发。人脑癌细胞系以及2d培养的癌症干细胞虽然也可以充当替代模型，但这些无法模拟3d的肿瘤环境。
3、类器官模型的发展，为直接在人体组织中模拟疾病，特别是模拟诸如脑胶质瘤的脑癌疾病开辟了新途径。
4、类器官是一种3d的细胞培养物，与人体器官拥有高度相似的组织学特征，并能在体外重现其生理功能；具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定性等特点。相比传统的2d培养模型，类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组、更适合于生物
5、现有的脑胶质瘤类器官的培养方法，一般先通过机械切碎和酶解(胶原酶和胰酶等)的方式对肿瘤组织处理，分离出细胞悬液，再将细胞悬液添加到基质胶(也称3d生物相容性基质，诸如胶原凝胶或水凝胶等)中，再在常规的类器官培养基中进行培养。
6、或者，通过精细手术剪刀将肿瘤组织切成小块后，用“基质胶”包被小块肿瘤组织，再将其置于常规的类器官培养基中培养。
7、然而现有的脑胶质瘤类器官的培养方法，一方面培养成功率不高，另一方面，即使成功培养获得的类器官模型与原发肿瘤组织在肿瘤微环境以及一些关键代表性的标记物(iba1、ki67、sox2、cd31等)的比例上还达不到很高的相似度；此外，现有的培养方法都必须使用“基质胶”这一比较昂贵的培养材料。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术一方面提供了一种人脑胶质瘤的类器官的构建方法，其中，所述构建方法包括以下步骤；
2、步骤1)，预处理：获取离体的人脑胶质瘤组织块，并进行修剪和清洗处理；
3、步骤2)，第一次分离操作：挑选其中的肿瘤组织，并将其分割成最大直径约为0.5-1cm的第一碎块；将所述第一碎块置于红细胞裂解液中，并在裂解过程结束后进行清洗；
4、步骤3)，第二次分离操作：将上述步骤2)获得的经清洗的第一碎块，分割成最大直径约为0.1～1mm的第二碎块；
5、步骤4)，第一阶段培养：将上述步骤3)获得的第二碎块置于人胶质瘤细胞培养基中，并在低氧环境下，摇床或振荡培养；
6、步骤5)：第二阶段培养：当第一阶段培养获得产物的最大直径约为0.6-2.0mm时，将其置于人胶质瘤细胞培养基中，并在低氧环境下，摇床或振荡培养获得所述人脑胶质瘤的类器官；
7、所述步骤5)中，所述人胶质瘤细胞培养基中含有50～300ng/ml重组人vegf；
8、所述步骤4)和步骤5)中，所述低氧环境中氧气浓度为3％～8％v/v。
9、在一个或多个实施方案中，所述低氧环境的氧气浓度为3％v/v、4％v/v、5％v/v、6％v/v、7％v/v、8％v/v；优选的，所述低氧环境的氧气浓度为5％v/v；更优选的，所述低氧环境中，氧气浓度为5％v/v，二氧化碳浓度为5％v/v，氮气浓度为90％v/v；优选的，所述低氧环境采用低氧或缺氧小室；更优选的，在37摄氏度恒温培养。
10、在一个或多个实施方案中，所述步骤5)中，所述人胶质瘤细胞培养基中，重组人vegf的浓度为60～250ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为70～200ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为80～180ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为90～150ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为100ng/ml～120ng/ml。
11、在一个或多个实施方案中，所述步骤4)中采用的人胶质瘤细胞培养基与所述步骤5)中采用的人胶质瘤细胞培养基的配方相同；或者，所述步骤5)中采用的人胶质瘤细胞培养基是在所述步骤4)中采用的人胶质瘤细胞培养基的基础上添加所述重组人vegf。
12、在一个或多个实施方案中，所述步骤4)中采用的人胶质瘤细胞培养基和所述步骤5)中采用的人胶质瘤细胞培养基的配方包括基础培养基和添加剂，所述基础培养基选自dmem/f12培养基、neurobasal培养基、hibernate培养基或它们复配后的组合培养基；优选的，所述基础培养基为dmem/f12培养基与neurobasal培养基按2：3～3：2的体积比复配后的组合培养基；更优选的，所述基础培养基为dmem/f12培养基与neurobasal培养基按1：1的体积比复配后的组合培养基；
13、所述添加剂包含n2添加剂、b-27添加剂、维生素添加剂和β-巯基乙醇；优选的，所述维生素添加剂为维生素a添加剂；
14、优选的，所述添加剂还包含抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素或两性霉素b中的任意一种或几种；更优选的，所述抗生素为pen-strep和两性霉素b；
15、优选的，所述添加剂还包含重组人egf、重组人bfgf、人胰岛素、y-27632、n-乙酰基-l-半胱氨酸中的任意一种或几种；
16、优选的，所述添加剂还包含必需氨基酸和非必需氨基酸，所述必需氨基酸选自l-谷氨酰胺、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽、l-亮氨酸、l-异亮氨酸、l-缬氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-色氨酸、l-苏氨酸、l-赖氨酸中的任意一种或几种；所述非必需氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的任意一种或几种。
17、在一个或多个实施方案中，在所述步骤4)中，摇床或振荡培养采用100～160rpm的转速，优选的，采用130rpm的转速。
18、在一个或多个实施方案中，在所述步骤1)中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人脑胶质瘤的类器官的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤；
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述人胶质瘤细胞培养基中，重组人VEGF的浓度为60～250ng/ml；优选的，重组人VEGF的浓度为70～200ng/ml；优选的，重组人VEGF的浓度为80～180ng/ml；优选的，重组人VEGF的浓度为90～150ng/ml；优选的，重组人VEGF的浓度为100ng/ml～120ng/ml。
4.如权利要求1至3所述的构建方法，其特征在于：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
6.如权利要求1至5中任意一项所述的构建方法，其特征在于：在所述步骤4)中，摇床或振荡培养采用100～160rpm的转速，优选的，采用130rpm的转速。
7.如权利要求1至5中任意一项所述的构建方法，其特征在于：在所述步骤1)中，获取离体的人脑胶质瘤组织块后，修剪掉血凝块和手术烧焦组织，并采用合适的培养基或缓冲液进行清洗处理。
<...【技术特征摘要】
1.一种人脑胶质瘤的类器官的构建方法，其特征在于：所述构建方法包括以下步骤；
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中，所述人胶质瘤细胞培养基中，重组人vegf的浓度为60～250ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为70～200ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为80～180ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为90～150ng/ml；优选的，重组人vegf的浓度为100ng/ml～120ng/ml。
4.如权利要求1至3所述的构建方法，其特征在于：
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于：
6.如权利要求1至5中任意一项所述的构建方法，其特征在于：在所述步骤4)中，摇床或振荡培养采用100～...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宇翔，陈艳艳，陈亮，齐曾鑫，杨华，付紫微，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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