【技术实现步骤摘要】
本申请涉及一种用于通用检测sars样冠状病毒和sars-cov-2病毒的检测组合(panel)以及使用该检测组合的方法。本申请的检测组合可被称为发现和创新中心(centerfor discovery and innovation，“cdi”)检测组合(cdi增强新冠肺炎测试(cdi enhancedcovid-19test))，还可包括检测组合中的附加引物/探针组，用于检测对照样本和临床试样中的人类核糖核酸酶p基因(rnase p，rp)。该检测组合设计用于使用e基因(囊膜)检测体系(assay)对sars样冠状病毒进行通用检测，以及使用n2(核衣壳)检测体系特异性检测sars-cov-2。
技术介绍
1、提供检测病毒的特异和敏感的检测体系对于准确诊断病例、评估疫情范围、监测干预策略和监测研究至关重要。用于检测病毒的检测体系包括n3(核衣壳，与人核酸交叉反应)检测体系和n1(核衣壳，被认为是sars-cov-2特异性的)检测体系。然而，n1体系被发现与sars冠状病毒具有轻微交叉反应，导致结果不准确。
技术实现思路
1、提供了一种检测样本中新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid-19(新冠肺炎))的方法。该方法包括采集疑似包含新型冠状病毒的样本，使用n2体系对样本的至少第一部分的sars-cov-2核衣壳(n)基因中一个区域进行分析，使用e体系检测样本的至少第二部分，以对sars冠状病毒(e)进行通用检测；以及使用人rpp30(h-rpp30
2、在本申请的另一个实施方案中，一种用于检测样本中的新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或新冠肺炎)的方法包括为多个检测中的每一个准备反应混合物(master mix)，其中所述体系包括：对新型冠状病毒(“ncov”)具有特异性的第一体系；对严重急性呼吸综合征(“sars”)相关冠状病毒保守的第二体系；以及作为内部对照的第三体系。在优选实施方案中，该方法还包括将一定量的反应混合物(例如，15μl)加载到多个孔的每一个孔中，其中所述孔由板分布图(plate map)限定；并将一定量的核糖核酸(“rna”)(例如5μl)添加到每个孔中，如板分布图所定义。该方法还可以包括将样本转移到磁感应循环仪(“mic”)，例如mic-qpcr循环仪(由bio molecular systems出售)；并运行mic循环仪。第一、第二和第三体系分别是n2体系、e体系和rp体系。rp体系和n2体系的反应混合物可包括：(1)2×一步法rt-pcr缓冲液iii；(2)takara ex taq hs(5u/μl)；(3)primescript rt酶混合物ii；(4)不含核糖核酸酶的蒸馏水(dh2o)；和(5)组合的引物/探针混合物。rp体系和n2体系的反应混合物还可包括至少10μl/反应的2×一步法rt-pcr缓冲液iii；0.4μl/反应的takara ex taq hs(5u/μl)；0.4μl/反应的primescript rt酶混合物ii；3μl/反应的无核糖核酸酶蒸馏水；和1.2μl/反应的组合引物/探针混合物。用于e体系的反应混合物可包括：(1)2×一步法rt-pcr缓冲液iii；(2)takara ex taq hs(5u/μl)；(3)primescript rt酶混合物ii；(4)不含核糖核酸酶的dh2o；和(5)e探针混合物。用于e体系的反应混合物还可包括至少10μl/反应的2×一步法rt-pcr缓冲液iii；0.4μl/反应的takaraex taq hs(5u/μl)；0.4μl/反应的primescript rt酶混合物ii；1.8μl/无核糖核酸酶蒸馏水的反应；和2.4μl/反应的e探针混合物。
3、所述方法还可以包括使用cdi-新冠肺炎体系创建新的运行；选择样本类型，其中所述样本类型为(1)未知、(2)ntc或(3)阳性对照；将所述样本分组，其中所述组为(1)n2、(2)e或(3)rp；并运行mic循环。cdi-新冠肺炎体系可包括热循环条件。热循环条件可包括第一阶段和第二阶段，第一阶段在42℃下运行5分钟，持续一个循环，第二阶段在95℃下运行5秒，在58℃下运行20秒，持续45个循环。
4、在本申请的另一实施方案中，用于检测新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或新冠肺炎)的方法包括提供cdi增强的新冠肺炎测试。cdi增强的新冠肺炎测试可能包括使用实时逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)检测，使用第一引物和探针组检测sars-cov-2核衣壳(n)基因中的一个区域，使用第二引物和探头组对sars样冠状病毒(e)进行通用检测，以及使用第三引物和探针组检测临床样本中的人类核糖核酸酶p(rp)。所述检测可以以单引物对(singleplex)形式运行，或者多引物对(mutiplex)嵌入到单个反应和扩增设置中。cdi增强的新冠肺炎测试也可能包括无模板阴性对照(ntc)，以检查提取和体系试剂是否存在污染。cdi增强的新冠肺炎检测可包括两个阳性对照，以验证正确的体系设置和sars-cov-2试剂的完整性。这两个阳性对照可以是，例如，用于rrt-pcr n2体系和e体系的阳性对照的病毒基因组rna，以及用于rp体系的阳性对照(rppc)的dna阳性对照。cdi增强型新冠肺炎测试可以在单个实时逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)测试中进行，每个平板包括一个阳性、一个阴性和一个提取对照，每个临床样本包含一个内部对照。
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1.一种检测样本中新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征-冠状病毒-2(SARS-CoV-2或新冠肺炎)的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述N2体系对新型冠状病毒(“nCoV”)是特异性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述E体系对所有严重急性呼吸综合征(“SARS”)相关冠状病毒是保守的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述RP体系是内部对照。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本采集自鼻咽、口咽、前鼻腔、中鼻甲鼻腔或上呼吸道，或血液、尿液或粪便中的至少一个。
6.一种检测样本中新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2或新冠肺炎)的方法，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一、第二和第三体系分别是N2体系、E体系和RP体系。
8.根据权利要求7所述的方法，其中用于RP体系和N2体系的反应混合物包括(1)2×一步RT-PCR缓冲液III，(2)TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)，(3)PrimeScript RT酶混合
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述用于RP体系和N2体系的反应混合物包括至少10μL/反应的2×一步RT-PCR缓冲液III、0.4μL/反应的TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、0.4μL/反应的PrimeScript RT酶混合物II、3μL/反应的无核糖核酸酶蒸馏水，以及1.2μL/反应的组合引物/探针混合物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中用于E体系的反应混合物包括(1)2×一步RT-PCR缓冲液III，(2)TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)，(3)PrimeScript RT酶混合物II，(4)无核糖核酸酶蒸馏水和(5)E探针混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述用于E体系的反应混合物包括至少10μL/反应的2×一步RT-PCR缓冲液III、0.4μL/反应的TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、0.4μL/反应PrimeScript RT酶混合物II、1.8μL/反应的无核糖核酸酶蒸馏水和2.4μL/反应的E探针混合物。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述平板分布图遵循下表：
13.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CDI-新冠肺炎体系包括热循环条件。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述热循环条件包括第一阶段和第二阶段，所述第一阶段在42℃下运行5分钟，共一个循环，所述第二阶段在95℃下运行5秒，在58℃下运行20秒，共45个循环。
16.一种检测新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2或新冠肺炎)的方法，包括：
17.根据权利要求16所述的方法，其中CDI增强的新冠肺炎测试还包括无模板阴性对照(NTC)，以检查提取和体系试剂的污染。
18.根据权利要求16所述的方法，其中CDI增强的新冠肺炎测试进一步包括两个阳性对照，用于验证正确的体系设置和SARS-CoV-2试剂的完整性。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述两个阳性对照是用于rRT-PCR N2体系和E体系的阳性对照的病毒基因组RNA；以及用于RP体系的阳性对照(RPPC)的DNA阳性对照。
20.根据权利要求16所述的方法，其中在单个实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测试中运行CDI增强的新冠肺炎测试，每个平板包括一个阳性、一个阴性和一个提取对照，并且每个临床样本包含一个内部提取对照。
...【技术特征摘要】
1.一种检测样本中新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征-冠状病毒-2(sars-cov-2或新冠肺炎)的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述n2体系对新型冠状病毒(“ncov”)是特异性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述e体系对所有严重急性呼吸综合征(“sars”)相关冠状病毒是保守的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述rp体系是内部对照。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样本采集自鼻咽、口咽、前鼻腔、中鼻甲鼻腔或上呼吸道，或血液、尿液或粪便中的至少一个。
6.一种检测样本中新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或新冠肺炎)的方法，包括：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一、第二和第三体系分别是n2体系、e体系和rp体系。
8.根据权利要求7所述的方法，其中用于rp体系和n2体系的反应混合物包括(1)2×一步rt-pcr缓冲液iii，(2)takara ex taq hs(5u/μl)，(3)primescript rt酶混合物ii，(4)无核糖核酸酶蒸馏水，和(5)组合引物/探针混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述用于rp体系和n2体系的反应混合物包括至少10μl/反应的2×一步rt-pcr缓冲液iii、0.4μl/反应的takara ex taq hs(5u/μl)、0.4μl/反应的primescript rt酶混合物ii、3μl/反应的无核糖核酸酶蒸馏水，以及1.2μl/反应的组合引物/探针混合物。
10.根据权利要求7所述的方法，其中用于e体系的反应混合物包括(1)2×一步rt-pcr缓冲液iii，(2)takara ex taq hs(5u/μl)，(3)primescript rt酶混合物ii，(4...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·S·佩尔林，赵雅男，史蒂文·帕克，
申请(专利权)人：哈肯萨克经络健康有限公司，
类型：发明
国别省市：
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