【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫荧光，特别地，涉及一种多重免疫荧光染色试剂盒。
技术介绍
1、肿瘤微环境是指肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境有着密切关系，它不仅包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，而且亦与肿瘤细胞自身的(核和胞质)内在环境有关。肿瘤细胞可以通过自分泌和旁分泌，改变和维持自身生存和发展的条件，促进肿瘤的生长和发展。全身和局部组织亦可通过代谢、分泌、免疫、结构和功能的改变，限制和影响肿瘤的发生和发展。肿瘤与环境，两者既是相互依存，相互促进，又是相互拮抗，相互斗争的。它是现代肿瘤生物学的一个关键和核心的问题。近年来由于肿瘤细胞学和分子生物学的进展，人们对于肿瘤和环境的相互关系有了更加深入的了解。这不仅对于认识肿瘤的发生、发展、转移等有着重要的意义，而且对于肿瘤的诊断、防治和预后亦有着重要的作用。
2、免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，随着免疫治疗的崛起，越来越多肿瘤微环境种的标志物被发现与疾病治疗、进展密切相关，对这些标志物进行同时染色标记、并研究它们之间的共定位、表达量和距离关系成为肿瘤免疫研究的普遍需求。
3、酪胺信号放大(tsa)是免疫组化染色的其中一种，但是，基于酪胺信号放大的免疫组化染色具有以下缺点：
4、1、循环染色周期长、易掉片，因此需要温和修复；
5、2、多次加热可能会破坏靶标特异性表位；
6、3、抗体和荧光团配对需额外优化。
技术实现思路
1、本专利技术目的在于提供一种多重
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种多重免疫荧光染色试剂盒，包括以下体积份的组分：过氧化物酶封闭液60份，抗体稀释液60份，dapi染液10份，polymer-hrp羊抗鼠/兔二抗30份，tsa缓冲液36份，荧光染料0.3份；其中，所述荧光染料选自tyr-480plus、tyr-520plus、tyr-570plus、tyr-620plus、tyr-690plus、tyr-780plus中的任一种或几种。
3、优选的，所述荧光染料为浓缩型，利用tsa缓冲液稀释后使用，荧光染料与tsa缓冲液的体积比为1：50～400。
4、进一步优选的，倘若一抗常温孵育1～3小时，则荧光染料与tsa缓冲液的体积比为1：50～200；倘若一抗4℃孵育过夜(16～20小时)，则荧光染料与tsa缓冲液的体积比为1：200～400。
5、优选的，所述荧光染料是tyr-480plus、tyr-520plus、tyr-570plus、tyr-620plus、tyr-690plus、tyr-780plus等体积配合使用。
6、优选的，所述试剂盒各组分的保存条件均为2～8℃。
7、本专利技术还提供了前述一种多重免疫荧光染色试剂盒的使用方法，具体步骤如下：
8、(1)样本准备；
9、(2)抗原修复；
10、(3)阻断内源性过氧化物酶；
11、(4)非特异性靶点封闭；
12、(5)孵育一抗；
13、(6)孵育多聚hrp二抗；
14、(7)tsa荧光染料反应液反应；
15、(8)抗体洗脱；
16、(9)dapi复染细胞核；
17、(10)封片；
18、(11)镜检拍照；
19、(12)结果判读。
20、优选的，步骤(1)中，所述样本为石蜡组织切片、冰冻切片、细胞爬片或细胞涂片中的任一种。
21、进一步优选的，倘若样本为石蜡组织切片，则依次将样本放入二甲苯ⅰ15min-二甲苯ⅱ15min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-体积百分数95％乙醇水溶液5min-体积百分数85％乙醇水溶液5min-体积百分数75％乙醇水溶液5min，蒸馏水洗。
22、进一步优选的，倘若样本为冰冻切片，则将样本固定30min，pbs洗5min，重复3次，滴加体积百分数0.3％triton-x100破膜液通透20min，pbs洗5min，重复3次。
23、进一步优选的，倘若样本为细胞爬片或者细胞涂片，则将样本固定30min，pbs洗5min重复3次，滴加体积百分数0.3％triton x-100破膜液通透20min，pbs洗5min，重复3次。
24、优选的，步骤(2)的具体方法为：将步骤(1)准备好的样本置于盛满ph 9.0edta碱性抗原修复液或者ph6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中进行抗原修复；微波处理，中火(60～70℃)8min，停火8min，转中低火(50～60℃)7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
25、进一步优选的，抗原修复采用微波辐照，或者90kpa高压2min后37℃水煮15min，或者37℃水浴20min。其中，微波辐照利用微波产生的辐射和瞬间热使甲醛固定时产生的醛键被打开，蛋白变性。微波辐照的工艺条件为：功率700w，中火(60～70℃)8分钟，停火8分钟，中低火(50～60℃)7分钟。
26、优选的，步骤(3)的具体方法为：将样本放入体积百分数3％过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
27、优选的，步骤(4)的具体方法为：样本稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用封闭用正常山羊血清(或者其他封闭液质量浓度3％bsa溶液)均匀覆盖组织，室温封闭30min。
28、优选的，步骤(5)的具体方法为：轻轻甩掉封闭液，在样本上滴加用抗体稀释液稀释好的一抗x，样本平放于避光湿盒内4℃孵育20h或者37℃孵育2h(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。关于一抗孵育，4℃最佳，反应最温和、背景较浅、反应时间长；37℃反应速度快，孵育时间短。
29、优选的，步骤(6)的具体方法为：玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；样本稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，pbs洗三次。
30、优选的，步骤(7)的具体方法为：将浓缩型荧光染料利用tsa缓冲液稀释后获得tsa荧光染料反应液，向样本滴加tsa荧光染料反应液均匀覆盖，室温反应1～15min(最佳时间5～10min)，pbs洗三次(预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步)。
31、优选的，步骤(8)的具体方法为：将样本置于抗原修复液中37℃水浴25-40min(根据不同抗体亲和力灵活调整时间)或者滴加适量37℃预热至完全溶解的mihc专用抗体洗脱液(冰冻切片/爬片/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多重免疫荧光染色试剂盒，其特征在于，包括以下体积份的组分：过氧化物酶封闭液60份，抗体稀释液60份，Dapi染液10份，Polymer-HRP羊抗鼠/兔二抗30份，TSA缓冲液36份，荧光染料0.3份；其中，所述荧光染料选自TYR-480Plus、TYR-520Plus、TYR-570Plus、TYR-620Plus、TYR-690Plus、TYR-780Plus中的任一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种多重免疫荧光染色试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为浓缩型，利用TSA缓冲液稀释后使用，荧光染料与TSA缓冲液的体积比为1：50～400。
3.权利要求1或2所述一种多重免疫荧光染色试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样本为石蜡组织切片、冰冻切片、细胞爬片或细胞涂片中的任一种。
5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：将步骤(1)准备好的样本置于盛满pH 9.0EDTA碱性抗原修复液或者pH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复
6.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法为：将样本放入体积百分数3％过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
7.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(4)的具体方法为：样本稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加用封闭用正常山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。
8.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(5)的具体方法为：轻轻甩掉封闭液，在样本上滴加用抗体稀释液稀释好的一抗X，样本平放于避光湿盒内4℃孵育20h或者37℃孵育2h。
9.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(6)的具体方法为：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min；样本稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。
10.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(7)的具体方法为：将浓缩型荧光染料利用TSA缓冲液稀释后获得TSA荧光染料反应液，向样本滴加TSA荧光染料反应液均匀覆盖，室温反应1～15min，PBS洗三次；
...【技术特征摘要】
1.一种多重免疫荧光染色试剂盒，其特征在于，包括以下体积份的组分：过氧化物酶封闭液60份，抗体稀释液60份，dapi染液10份，polymer-hrp羊抗鼠/兔二抗30份，tsa缓冲液36份，荧光染料0.3份；其中，所述荧光染料选自tyr-480plus、tyr-520plus、tyr-570plus、tyr-620plus、tyr-690plus、tyr-780plus中的任一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种多重免疫荧光染色试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为浓缩型，利用tsa缓冲液稀释后使用，荧光染料与tsa缓冲液的体积比为1：50～400。
3.权利要求1或2所述一种多重免疫荧光染色试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤如下：
4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样本为石蜡组织切片、冰冻切片、细胞爬片或细胞涂片中的任一种。
5.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法为：将步骤(1)准备好的样本置于盛满ph 9.0edta碱性抗原修复液或者ph6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中进行抗原修复；微波处理，中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片；自然冷...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴恙，孙卓，
申请(专利权)人：湖南艾方生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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