【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
1.总体来说，本公开涉及干细胞生物学领域。更具体而言，它涉及对诱导的多能干细胞中的基因进行密码子优化以减少基因的快速沉默的方法。2.相关技术的描述研究表明，看似相同的细胞系在性能上存在显著差异(kyttala,2016)。在比较来自同一供体的多个克隆时检测到的这些差异被称为“克隆间变异”。认为这些克隆含有相同的dna序列，并且在某些情况下得到证实。同一细胞系不同分化批次的产量和纯度不一致被称为“批次间变异”。在许多情况下，将分化性能的差异归因于表观遗传修饰；然而，仍有需求尚未得到满足，即鉴定特定的表观遗传机制和改变这些表观遗传机制以防止细胞系中的变异的方法。
技术介绍
技术实现思路
1、在第一实施方案中，本公开提供了一种经工程化改造以表达至少一种转基因的分离细胞系，其中该至少一种转基因(a)受与seq id no:1-12或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的启动子控制；(b)受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制；和/或(c)由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码。在某些方面，该细胞系是诱导性多能干细胞(ipsc)系。
2、在一些方面，经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列与seq id no:14或seq id no:16具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、9
3、在一些方面，存在至少一种转基因，其中该至少一种转基因(a)受与seq id no:1-12或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的启动子控制；和/或(b)受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。在特定方面，该至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码。
4、在某些方面，该至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受与seq id no:1-12或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的启动子控制。在一些方面，该至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。在特定方面，该至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1和myl6组成的组的内源性基因控制。
5、在其他方面，该细胞系经工程化改造以表达至少第一转基因和第二转基因。在一些方面，第一转基因受与seq id no:1-12或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的启动子控制，并且第二转基因受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。在其他方面，第一转基因受与seq id no:1-12或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的启动子控制，并且第二转基因受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1和myl6组成的组的内源性基因控制。在一些方面，第一转基因和/或第二转基因由经修饰以去除cpg基序用于稳定表达的序列编码。在特定方面，去除了至少50％，诸如至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的cpg基序。在特定方面，去除了所有cpg基序。在一些方面，将cpg基序密码子替换为并不稀有和/或不生成单核苷酸延伸(stretch)的密码子。在特定方面，将cpg基序密码子替换为表1中相应的密码子。
6、在一些方面，启动子是应答元件。在某些方面，启动子由应答元件驱动。
7、在一些方面，转基因是报告基因或选择标志物。在某些方面，报告基因是荧光或发光蛋白，诸如萤光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)。在某些方面，该至少一种转基因是选择标志物，诸如嘌呤霉素、新霉素或杀稻瘟素。在特定方面，该至少一种转基因是自杀基因。在一些方面，该至少一种转基因是胸苷激酶、tet或成肌细胞决定蛋白1(myod1)。
8、在特定方面，细胞系稳定表达转基因达至少30天，诸如至少2个月、3个月、4个月、5个月或更长时间。在特定方面，细胞系在六个月内，诸如在一年内、在两年内或在三年内稳定表达转基因。
9、在一些方面，该至少一种转基因由表达盒编码。在某些方面，通过电穿孔或脂质转染将该至少一种转基因导入细胞系中。在特定方面，将表达盒在基因组安全港位点，诸如ppp1r12c(aavs1)基因座或rosa基因座处插入。
10、在某些方面，启动子与seq id no:2、3、4、6或17具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性。在一些方面，启动子包含seqid no:2、3、4、6或17。
11、在特定方面，该方法包括基因编辑，具体而言，转基因包括基因编辑，诸如talen介导的基因编辑、crispr介导的基因编辑或zfn介导的基因编辑。
12、另一实施方案提供了一种防止工程化细胞系中转基因表达沉默的方法，包括优化转基因序列以去除cpg基序。
13、在一些方面，优化包括替换基本上所有的cpg基序密码子。在某些方面，优化包括替换至少50％的cpg基序，诸如去除至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的cpg基序。在特定方面，去除了所有cpg基序。在特定方面，将cpg基序密码子替换为并不稀有和/或不生成单核苷酸延伸的密码子。在一些方面，将cpg基序密码子替换为表1中相应的密码子。在特定方面，经优化以去除cpg基序的转基因序列包含与野生型转基因序列的gc含量百分比基本相似的gc含量百分比。
14、在一些方面，转基因序列是报告基因，诸如荧光蛋白，例如gfp或rfp。
15、在某些方面，转基因受组成型启动子的控制。在一些方面，组成型启动子在几乎所有细胞类型中都有表达。在特定方面，组成型启动子基本上在所有细胞类型中都有表达。在某些方面，组成型启动子在所有细胞类型中都有表达。
16、在特定方面，转基因受诱导型启动子的控制。在一些方面，转基因受eef1a1启动子的控制。
17、在另外的方面，该方法进一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经工程化改造以表达至少一种转基因的分离细胞系，其中所述至少一种转基因：(a)受与SEQ ID NO:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制；(b)受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1、MYL6、UBA52、CAG、RPS和UBC组成的组的内源性基因控制；和/或(c)由经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列编码。
2.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因：(a)受与SEQ ID NO:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制；和/或(b)受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1、MYL6、UBA52、CAG、RPS和UBC组成的组的内源性基因控制。
3.权利要求2所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列编码。
4.权利要求3所述的细胞系，其中所述经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性。
5.权利要求3所述的细胞系，其中所述经修饰以去除CpG基序从而
6.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受与SEQ ID NO:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制。
7.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1、MYL6、UBA52、CAG、RPS和UBC组成的组的内源性基因控制。
8.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除CpG基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1和MYL6组成的组的内源性基因控制。
9.权利要求1-8中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系经工程化改造以表达至少第一转基因和第二转基因。
10.权利要求9所述的细胞系，其中所述第一转基因受与SEQ ID NO:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制，并且所述第二转基因受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1、MYL6、UBA52、CAG、RPS和UBC组成的组的内源性基因控制。
11.权利要求9所述的细胞系，其中所述第一转基因受与SEQ ID NO:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制，并且所述第二转基因受选自由HSP90AB1、ACTB、CTNNB1和MYL6组成的组的内源性基因控制。
12.权利要求9或11所述的细胞系，其中所述第一转基因和/或第二转基因由经修饰以去除CpG基序用于稳定表达的序列编码。
13.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少50％的所述CpG基序。
14.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少70％的所述CpG基序。
15.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少90％的所述CpG基序。
16.权利要求1-15中任一项所述的细胞系，其中去除了所有CpG基序。
17.权利要求1-16中任一项所述的细胞系，其中将所述CpG基序密码子替换为并不稀有和/或不生成单核苷酸延伸的密码子。
18.权利要求1-17中任一项所述的细胞系，其中将所述CpG基序密码子替换为表1中相应的密码子。
19.权利要求1-18中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是诱导性多能干细胞(iPSC)系。
20.权利要求1-19中任一项所述的细胞系，其中所述转基因是报告基因或选择标志物。
21.权利要求1-20中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是报告基因。
22.权利要求21所述的细胞系，其中所述报告基因是荧光蛋白。
23.权利要求21所述的细胞系，其中所述报告基因是绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(RFP)。
24.权利要求1-23中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是选择标志物。
25.权利要求24所述的细胞系，其中所述选择标志物是嘌呤霉素、新霉素或杀稻瘟素。
26.权利要求1-23中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是自杀基因。
27.权利要求1-25中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是胸苷激酶、TET或成肌细胞决定蛋白1(MYOD1)。
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【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种经工程化改造以表达至少一种转基因的分离细胞系，其中所述至少一种转基因：(a)受与seq id no:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制；(b)受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制；和/或(c)由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码。
2.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因：(a)受与seq id no:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制；和/或(b)受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。
3.权利要求2所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码。
4.权利要求3所述的细胞系，其中所述经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列与seq id no:14或seq id no:16具有至少90％序列同一性。
5.权利要求3所述的细胞系，其中所述经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列是seq id no:14或seq id no:16。
6.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受与seq id no:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制。
7.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。
8.权利要求1所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由经修饰以去除cpg基序从而提供稳定表达的序列编码，并且受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1和myl6组成的组的内源性基因控制。
9.权利要求1-8中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系经工程化改造以表达至少第一转基因和第二转基因。
10.权利要求9所述的细胞系，其中所述第一转基因受与seq id no:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制，并且所述第二转基因受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1、myl6、uba52、cag、rps和ubc组成的组的内源性基因控制。
11.权利要求9所述的细胞系，其中所述第一转基因受与seq id no:1-12或17具有至少90％序列同一性的启动子控制，并且所述第二转基因受选自由hsp90ab1、actb、ctnnb1和myl6组成的组的内源性基因控制。
12.权利要求9或11所述的细胞系，其中所述第一转基因和/或第二转基因由经修饰以去除cpg基序用于稳定表达的序列编码。
13.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少50％的所述cpg基序。
14.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少70％的所述cpg基序。
15.权利要求1-12中任一项所述的细胞系，其中去除了至少90％的所述cpg基序。
16.权利要求1-15中任一项所述的细胞系，其中去除了所有cpg基序。
17.权利要求1-16中任一项所述的细胞系，其中将所述cpg基序密码子替换为并不稀有和/或不生成单核苷酸延伸的密码子。
18.权利要求1-17中任一项所述的细胞系，其中将所述cpg基序密码子替换为表1中相应的密码子。
19.权利要求1-18中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是诱导性多能干细胞(ipsc)系。
20.权利要求1-19中任一项所述的细胞系，其中所述转基因是报告基因或选择标志物。
21.权利要求1-20中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是报告基因。
22.权利要求21所述的细胞系，其中所述报告基因是荧光蛋白。
23.权利要求21所述的细胞系，其中所述报告基因是绿色荧光蛋白(gfp)或红色荧光蛋白(rfp)。
24.权利要求1-23中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是选择标志物。
25.权利要求24所述的细胞系，其中所述选择标志物是嘌呤霉素、新霉素或杀稻瘟素。
26.权利要求1-23中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是自杀基因。
27.权利要求1-25中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因是胸苷激酶、tet或成肌细胞决定蛋白1(myod1)。
28.权利要求1-27中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系在六个月内稳定表达所述转基因。
29.权利要求1-28中任一项所述的细胞系，其中所述至少一种转基因由表达盒编码。
30.权利要求1-29中任一项所述的细胞系，其中通过电穿孔或脂质转染将所述至少一种转基因导入所述细胞系中。
31.权利要求1-30中任一项所述的细胞系，其中将所述表达盒在基因组安全港位点处插入。
32.权利要求31所述的细胞系，其中所述基因组安全港位点是ppp1r12c(aavs1)基因座或rosa基因座。
33.权利要求1-32中任一项所述的细胞系，其中所述启动子与seq id no:2、3、4、6或17具有至少90％序列同一性。
34.权利要求1-33中任一项所述的细胞系，其中所述启动子与seq id no:2、3、4、6或17具有至少95％序列同一性。
35.权利要求1-34中任一项所述的细胞系，其中所述启动子包含seq id no:2、3、4、6或17。
36.权利要求1-35中任一项所述的细胞系，其中所述启动子是应答元件。
37.权利要求1-35中任一项所述的细胞系，其中所述启动子由应答元件驱动。
38.权利要求1-35中任一项所述的细胞系，其中所述转基因包含基因编辑。
39.权利要求38所述的细胞系，其中基因编辑包括talen介导的基因编辑、crispr介导的基因编辑或zfn介导的基因编辑。
40.一种防止工程化细胞系中转基因表达沉默的方法，包括优化所述转基因序列以去除cpg基序。
41.权利要求40所述的方法，其中优化包括替换基本上所有的cpg基序密码子。
42.权利要求40所述的方法，其中优化包括替换去除掉至少50％的所述cpg基序。
43.权利要求40所述的方法，其中去除了至少70％的所述cpg基序。
44.权利要求40所述的方法，其中去除了至少90％的所述cpg基序。
45.权利要求40所述的方法，其中去除了所有cpg基序。
46.权利要求40-45中任一项所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·迪克森，S·伯顿，C·姆恩，M·多内根，M·麦克拉驰兰，D·拉杰什，T·伯克，
申请(专利权)人：富士胶片细胞动力公司，
类型：发明
国别省市：
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