System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind()
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因工程与代谢工程应用领域,尤其是涉及一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、十字花科植物菘蓝(isatis indigotica fort.)的干燥根入药为板蓝根,是当下治疗流感应用最广泛的中药品种之一,具有清热解毒,凉血利咽等功效。临床用于治疗风热感冒,咽喉肿痛,病毒性感染以及传染病流行期间的预防。有研究发现木脂素苷类化合物是板蓝根主要抗病毒活性成分(图1),包括以落叶松脂素(lariciresinol,lar)为母核的糖基化产物直铁线莲宁b(clemastanin b,lariciresinol-4,4'-bis-o-β-d-glycopyranoside,ldg)和落叶松脂素-4-o-葡萄糖苷(lariciresinol-4-bis-o-β-d-glycopyranoside,l4g);及以松脂素(pinoresinol,pin)为母核的糖基化产物松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
2、目前,植物提取法是获得木脂素苷的主要方法。前期对赤峰、亳州和阜阳等12个板蓝根主产区的药材进行定量分析,发现l4g及其前体lar的平均含量仅为47.14μg/g和84.67μg/g,仅占全株的0.047%和0.086%。极低的木脂素苷含量严重限制板蓝根的深度开发和临床应用。利用合成生物学方法构建高效生产抗病毒活性木脂素苷的细胞工厂,实现药效活性成分的稳定供应,是满足临床需求和实现菘蓝(板蓝根基原植物)资源可持续利用的基础。
3、迄今,能合成抗病毒活性木脂素苷直铁线莲宁b
技术实现思路
1、基于目前缺少能合成抗病毒活性木脂素苷直铁线莲宁b、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的微生物菌株的现状,本专利技术提供一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用。
2、本专利技术基于模块化的合成生物学策略和多水平代谢工程策略,在酿酒酵母中重构木脂素苷直铁线莲宁b、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷的合成途径,首次实现了以环保无污染的方式合成了复杂苯丙素类化合物抗病毒活性木脂素苷。本专利技术提供的合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够发酵生产直铁线莲宁b、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现:
4、本申请的第一方面,提供一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够生产木脂素苷直铁线莲宁b、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷,以酿酒酵母为出发菌株进行基因改造,获得所合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌,所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种:
5、(1)整合coal模块;
6、(2)整合coal模块和pin模块;
7、(3)整合coal模块、pin模块和lar模块;
8、(4)整合coal模块、pin模块和ugt模块;
9、(5)整合coal模块、pin模块、lar模块和ugt模块;
10、其中,可选地,coal模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合:酿酒酵母密码子优化过的毛果杨populus trichocarpa 4-香豆酸辅酶a连接酶4cl的编码基因ptr4cl3、ptr4cl5,酿酒酵母密码子优化过的菘蓝isatis indigotica 4-香豆酸辅酶a连接酶4cl的编码基因ii4cl3,酿酒酵母密码子优化过的拟南芥arabidopsis thaliana肉桂酰辅酶a还原酶ccr的编码基因atccr1,酿酒酵母密码子优化过的毛果杨p.trichocarpa肉桂酰辅酶a还原酶ccr的编码基因ptrccr2,以及酵母内源醇脱氢酶adh6的编码基因scadh6;
11、可选地,pin模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合:酿酒酵母密码子优化过的谷氨酸棒状杆菌corynebacterium glutamicum漆酶的编码基因cgl1,酿酒酵母密码子优化过的栓菌trametes sp.c30漆酶lac的编码基因tslac3,酿酒酵母密码子优化过的云芝trametes versicolor漆酶lac的编码基因tvlac1和菘蓝i.indigotica指导蛋白dir的编码基因iidir1、iidir2;
12、可选地,lar模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合:酿酒酵母密码子优化过的拟南芥a.thaliana松脂素还原酶prr的编码基因atprr,酿酒酵母密码子优化过的菘蓝i.indigotica松脂素还原酶plr的编码基因iiplr1,酿酒酵母密码子优化过的桃儿七sinopodophyllum hexandrum松脂素还原酶plr的编码基因shplr;
13、可选地,ugt模块中导入的外源基因选自以下中的一种或几种的组合:菘蓝i.indigotica糖基转移酶ugt的编码基因iiugt71b2、iiugt71b5a、iiugt71b5b,以及酵母内源磷酸葡萄糖糖化酶pgm1的编码基因scpgm1和udp-葡萄糖焦磷酸化酶ugp1的编码基因scugp1。
14、在本专利技术的一个实施方式中,优选地,pin模块中效果最优的酶组合为:栓菌漆酶lac的编码基因为n端截短22个氨基酸的漆酶lac截短体的编码基因,命名为trtslac3;菘蓝指导蛋白dir1的编码基因为n端截短23个氨基酸的指导蛋白dir1截短体的编码基因,命名为triidir1;菘蓝指导蛋白dir2的编码基因为n端截短28个氨基酸的指导蛋白dir2截短体的编码基因,命名为triidir2。
15、在本专利技术的一个实施方式中,优选地,ugt模块中对菘蓝糖基转移酶iiugt71b2、iiugt71b5a、iiugt71b5b采用多拷贝整合,所述多拷贝为1至3个拷贝,优选为3拷贝整合。
16、在本专利技术的一个实施方式中,合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法中,所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种:
17、(a)整合coal模块时:增加1个拷贝的毛果杨4-香豆酸辅酶a连接酶4cl的编码基因ptr4cl5,毛果杨肉桂酰辅酶a还原酶ccr的编码基因ptrccr2,以及酵母内源醇脱氢酶adh6的编码基因scadh6;
18、(b)整合coal模块和pin模块时:(a)的基础上,增加1个拷贝的n端截短22个氨基酸的栓菌漆酶lac截短体的编码基因trtslac3,分别和1个拷贝的n端截短23个氨基酸的菘蓝指导蛋白dir1截短体的编码基因triidir1的组合,及1个拷贝的n端截短28个氨基酸的菘蓝指导蛋白dir2截短体的编码基因triidir2的组合;
19、(c)整合coal模块、pin模块和lar模块时:(b)的基础上,增加1个拷贝的菘蓝松脂素还原酶plr的编码基因iiplr1;
20、(d)整合coal模块、pin模块和ugt模块时:(b)的基础上,分别增加1个拷贝的菘蓝糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够生产木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷;
2.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,Pin模块的酶选自以下的组合:栓菌漆酶Lac的编码基因为N端截短22个氨基酸的漆酶Lac截短体的编码基因trTsLAC3;菘蓝指导蛋白Dir1的编码基因为N端截短23个氨基酸的指导蛋白Dir1截短体的编码基因trIiDIR1;菘蓝指导蛋白Dir2的编码基因为N端截短28个氨基酸的指导蛋白Dir2截短体的编码基因trIiDIR2。
3.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,UGT模块中对菘蓝糖基转移酶IiUgt71B2、IiUgt71B5a、IiUgt71B5b采用3拷贝整合。
4.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种:
5.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒
6.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,出发菌株选择表达Cas9蛋白且敲除GAL80基因的酿酒酵母,或经过基因改造后能合成丰富阿魏酸(FA)前体的酿酒酵母菌株。
7.一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌,采用权利要求1-6所述的构建方法得到,其特征在于,
8.权利要求1~6任一项所述方法得到的工程菌、权利要求7所述的工程菌在合成木脂素苷直铁线莲宁B、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷中的应用。
9.一种木脂素苷的制备方法,其特征在于,发酵培养权利要求1~6任一项所述方法得到的工程菌、权利要求7所述的工程菌,并提取获得的木脂素苷;
10.根据权利要求9所述的一种木脂素苷的制备方法,其特征在于,所述葡萄糖在所述培养基A中的含量为10~20g/L,阿魏酸在所述培养基A中的含量为50~300mg/L;
...【技术特征摘要】
1.一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,所述合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌能够生产木脂素苷直铁线莲宁b、松脂素单糖苷和松脂素双糖苷;
2.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,pin模块的酶选自以下的组合:栓菌漆酶lac的编码基因为n端截短22个氨基酸的漆酶lac截短体的编码基因trtslac3;菘蓝指导蛋白dir1的编码基因为n端截短23个氨基酸的指导蛋白dir1截短体的编码基因triidir1;菘蓝指导蛋白dir2的编码基因为n端截短28个氨基酸的指导蛋白dir2截短体的编码基因triidir2。
3.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,ugt模块中对菘蓝糖基转移酶iiugt71b2、iiugt71b5a、iiugt71b5b采用3拷贝整合。
4.根据权利要求1所述的一种合成植物木脂素苷的酿酒酵母工程菌的构建方法,其特征在于,所述基因改造方式选自以下方式中的任意一种:
<...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。