【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于不进行增殖而进行分析的制备包含受试者来源的血中循环肿瘤细胞的试样的方法、和不进行增殖而对受试者来源的血中循环肿瘤细胞进行分析的方法。特别地本公开涉及制备用于鉴定受试者所具有的新抗原的试样的方法、和从该试样中鉴定受试者所具有的新抗原的方法、进一步制造用于使用受试者所具有的新抗原的树突状细胞疗法的细胞的方法。
技术介绍
1、当前，作为免疫检查点抑制剂的下一代的免疫疗法，关注使用新抗原的癌免疫疗法。新抗原也被称为新抗原或新生抗原，是因在癌细胞中产生的基因变异而新出现的变异抗原。新抗原根据各个患者而不同，因此期待在个体化医疗中的应用。此外，已知癌组织内新产生的新抗原引起强力的免疫反应，还暗示了与免疫检查点抑制剂等癌免疫疗法的良好匹配性。
技术实现思路
1、用于解决课题的手段
2、本专利技术人等发现了作为用于新抗原鉴定的试样，不使用以往认为必要的量的肿瘤组织，而从患者的血液试样中鉴定新抗原的方法。此外，本专利技术人等发现了从患者的血液试样中制备能够用于除了新抗原鉴定之外的分析的试样的方法。
3、因此，本公开提供以下。
4、(项目x1)
5、用于不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而进行分析的制备包含受试者来源的血中循环肿瘤细胞的试样的方法，其包括：
6、从使用血液成分单采术(apheresis)由该受试者采集的外周血单个核细胞中分离单核细胞的步骤，其中，进行前述血液成分单采术的血液成分单采术条件包括血中循环肿瘤细胞浓缩条
7、从分离了单核细胞的该外周血单个核细胞中分离血中循环肿瘤细胞的步骤；
8、根据需要，确认该分析所需要的血中循环肿瘤细胞的纯度的步骤；和
9、根据需要，对该血中循环肿瘤细胞进行用于该分析的前处理的步骤。
10、(项目x2)
11、根据上述项目所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
12、(项目x3)
13、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
14、(项目x4)
15、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
16、(项目x5)
17、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
18、(项目x6)
19、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
20、(项目x7)
21、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗epcam抗体、抗vimentin抗体、抗n-cadherin抗体、抗cd20抗体、抗e-cadherin抗体、抗desmoglein-3抗体、抗syndecan-1抗体、抗cd99抗体、抗cd81抗体和pax3抗体。
22、(项目x8)
23、根据上述项目中任一项所述的方法，其进一步包括将前述血中循环肿瘤细胞冷冻的步骤。
24、(项目x9)
25、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述分析包括全外显子组分析、全基因组分析、rna-seq、单细胞rna-seq、蛋白质组分析和转录组分析。
26、(项目x10)
27、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述试样用于通过进行前述分析而鉴定前述受试者所具有的新抗原。
28、(项目x11)
29、根据上述项目中任一项所述的方法，其进一步包括从前述血中循环肿瘤细胞中提取dna、rna或蛋白质的步骤。
30、(项目x12)
31、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述dna或rna至少提取约100pg。
32、(项目x13)
33、不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而对受试者来源的血中循环肿瘤细胞进行分析的方法，其包括：
34、从使用血液成分单采术由该受试者采集的外周血单个核细胞中分离单核细胞的步骤，其中，进行前述血液成分单采术的血液成分单采术条件包括血中循环肿瘤细胞浓缩条件；
35、从分离了单核细胞的该外周血单个核细胞中分离血中循环肿瘤细胞的步骤；和
36、使用该血中循环肿瘤细胞进行分析的步骤。
37、(项目x14)
38、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
39、(项目x15)
40、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
41、(项目x16)
42、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
43、(项目x17)
44、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
45、(项目x18)
46、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
47、(项目x19)
48、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗epcam抗体、抗vimentin抗体、抗n-cadherin抗体、抗cd20抗体、抗e-cadherin抗体、抗desmoglein-3抗体、抗syndecan-1抗体、抗cd99抗体、抗cd81抗体和pax3抗体。
49、(项目x20)
50、根据上述项目中任一项所述的方法，其进一步包括将前述血中循环肿瘤细胞冷冻的步骤。
51、(项目x21)
52、根据上述项目中任一项所述的方法，其中，该分析包括全外显子组分析、全基因组分析、rna-seq、单细胞rna-seq、蛋白质组分析和转录组分析。
53、(项目x22)
54、通过上述项目中任一项所述的方法对前述受试者来源的前述血中循环肿瘤细胞进行分析，由此鉴定前述受试者所具有的新抗原的方法。
55、(项目x23)
56、根据上述项目中任一项所述的方法，其进一步包括从前述血中循环肿瘤细胞中提取dna、rna或蛋白质的步骤。
57、(项目x24)
58、根据上述项目中任一项所述的方法，其进一步包括：
59、由前述dna或rna制作dna/rna测序文库的步骤；和
60、基于前述测序文库的变异信息，鉴定新抗原的步骤；
61、其中，前述血中循环肿本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而进行分析的制备包含受试者来源的血中循环肿瘤细胞的试样的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗EpCAM抗体、抗Vimentin抗体、抗N-Cadherin抗体、抗CD20抗体、抗E-Cadherin抗体、抗Desmoglein-3抗体、抗Syndecan-1抗体、抗CD99抗体、抗CD
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其进一步包括将前述血中循环肿瘤细胞冷冻的步骤。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，前述分析包括全外显子组分析、全基因组分析、RNA-Seq、单细胞RNA-Seq、蛋白质组分析和转录组分析。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，前述试样用于通过进行前述分析而鉴定前述受试者所具有的新抗原。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其进一步包括从前述血中循环肿瘤细胞中提取DNA、RNA或蛋白质的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，前述DNA或RNA至少提取约100pg。
13.不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而对受试者来源的血中循环肿瘤细胞进行分析的方法，其包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
18.根据权利要求13～17中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗EpCAM抗体、抗Vimentin抗体、抗N-Cadherin抗体、抗CD20抗体、抗E-Cadherin抗体、抗Desmoglein-3抗体、抗Syndecan-1抗体、抗CD99抗体、抗CD81抗体和PAX3抗体。
20.根据权利要求13～19中任一项所述的方法，其进一步包括将前述血中循环肿瘤细胞冷冻的步骤。
21.根据权利要求13～20中任一项所述的方法，其中，该分析包括全外显子组分析、全基因组分析、RNA-Seq、单细胞RNA-Seq、蛋白质组分析和转录组分析。
22.通过权利要求13～21中任一项所述的方法对前述受试者来源的前述血中循环肿瘤细胞进行分析，由此鉴定前述受试者所具有的新抗原的方法。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，进一步包括从前述血中循环肿瘤细胞中提取DNA、RNA或蛋白质的步骤。
24.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括：
25.根据权利要求24所述的方法，其中，前述分析包括前述DNA的全外显子组分析。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，前述分析进一步包括前述血中循环肿瘤细胞的蛋白质组分析。
27.根据权利要求23～26中任一项所述的方法，其中，前述DNA或RNA至少提取约100pg。
28.制造用于使用受试者所具有的新抗原的树突状细胞疗法的细胞的方法，其包括：
29.根据权利要求28所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.用于不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而进行分析的制备包含受试者来源的血中循环肿瘤细胞的试样的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗epcam抗体、抗vimentin抗体、抗n-cadherin抗体、抗cd20抗体、抗e-cadherin抗体、抗desmoglein-3抗体、抗syndecan-1抗体、抗cd99抗体、抗cd81抗体和pax3抗体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其进一步包括将前述血中循环肿瘤细胞冷冻的步骤。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，前述分析包括全外显子组分析、全基因组分析、rna-seq、单细胞rna-seq、蛋白质组分析和转录组分析。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，前述试样用于通过进行前述分析而鉴定前述受试者所具有的新抗原。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其进一步包括从前述血中循环肿瘤细胞中提取dna、rna或蛋白质的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，前述dna或rna至少提取约100pg。
13.不进行核酸扩增和/或基于培养的增殖而对受试者来源的血中循环肿瘤细胞进行分析的方法，其包括：
14.根据权利要求13所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括将溢出容量和/或血沉棕黄层容量设为血中循环肿瘤细胞浓缩条件。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，前述血液成分单采术条件包括约9～约12ml的溢出容量和/或约7～约10ml的血沉棕黄层容量。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的方法，其中，前述分离血中循环肿瘤细胞的步骤使用单克隆抗体、或通过大小分级进行。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，前述血中循环肿瘤细胞为约1×103个以上。
18.根据权利要求13～17中任一项所述的方法，其中，前述外周血单个核细胞为约1×104个以上。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，前述单克隆抗体包含抗epcam抗体、抗vimentin抗体、抗n-cadherin抗体、抗cd20抗体、抗e-cadherin抗体、抗desmoglein-3抗体、抗syndecan-1抗体、抗c...
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