【技术实现步骤摘要】
本申请涉及基因检测领域，更具体地说，它涉及一种用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、随着生物技术的发展，核酸检测技术已经广泛应用于众多方面，包括snp检测、hla分型、分型和耐药性检测、疾病诊断与个体用药、病原体微生物的鉴定等。通常从样品中提取的核酸不足以用于核酸检测，因此需要利用试剂与温度变化对靶核酸进行扩增。扩增的方法主要有pcr、lamp、nasba等，其中pcr是最常用的核酸扩增方式，通过体外模拟dna复制过程，使dna分子在短时间内完成大量扩增。对于扩增后产物的检测也有多种不同的方法，例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭(eb)染色，紫外灯下观察结果，可检测出微克级及纳克水平的核酸，但灵敏度和特异性差，而且有eb污染。标准印迹和同位素标记检测pcr扩增产物时，费时费力且有放射性污染。相比之下pcr产物与特异性探针结合的方法是目前最高效实用的方法且应用广泛。
2、传统的引物探针设计方法主要有两种，不对称pcr扩增法和标签法。不对称pcr的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链dna(ss-dna)。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-dna。也可用普通pcr制备靶dna双链dna(ds-dna)，再以ds-dna为模板，只用其中一种过量引物进行单引物pcr制备ss-dna。这种方法的缺点在于容易出现非特异扩增，电泳时可见弥散条带。
3、据中
4、综上，现有的引物探针设计方法有非特异扩增多，通量低，设计复杂，操作繁琐，成本高等问题。鉴于此，本申请提出一种新的引物探针涉及方法，以针对多种靶基因实现多重pcr熔解曲线分析。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本申请提供一种用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法、试剂盒及其应用。
2、本申请提供采用如下的技术方案：
3、第一方面，本申请提供一种用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其包括：针对每种待测靶基因序列，分别设计特异性的上游引物、下游引物和荧光探针，其中上游引物的3’端连接有荧光淬灭基团，荧光探针的5’端连接有荧光发光基团，荧光探针的长度为60～70bp，且在特异性结合后荧光探针5’端的荧光发光基团与上游引物3’端的荧光淬灭基团之间的碱基数为1～5个；
4、配制多重pcr反应体系，多重pcr反应体系包括每种靶标基因的模版dna、上游引物、下游引物以及荧光探针；
5、进行多重pcr扩增程序，扩增结束后，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断靶标基因的基因型。
6、进一步地，上述多重pcr反应体系中，针对每种待测靶基因的引物探针比例为：上游引物：下游引物：探针＝2:2:1。
7、进一步地，上述在进行熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：
8、将多重pcr扩增程序的产物在闭管条件下于94-98℃下保持0.5-2min后，降温至60-70℃下保持3-8min，再连续升温至80-84℃,连续采集荧光信号。
9、进一步地，上述在进行熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序中的升温速率和降温速率均为0.04-0.08℃/s。
10、进一步地，上述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2和bhq3中的任一种，荧光发光基团选自fam、hex、rox和cy5中的任一种。
11、第二方面，本申请提供一种用于单管检测多种靶基因的多重pcr试剂盒，其用于实现上述多重pcr熔解曲线分析方法，其包括：
12、用于扩增对应靶基因序列的pcr引物，每种靶基因序列的pcr引物包括上游引物和下游引物，上游引物的3’端连接有荧光淬灭基团；
13、用于特异性结合靶标序列的荧光探针，荧光探针的5’端连接有荧光发光基团，荧光探针的长度为60～70bp，且在特异性结合后荧光探针5’端的荧光发光基团与上游引物3’端的荧光淬灭基团之间的碱基数为1～5个；
14、以及，用于构建多重pcr反应体系的缓冲试剂。
15、进一步地，荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2和bhq3中的任一种，荧光发光基团选自fam、hex、rox和cy5中的任一种。
16、第三方面，本申请提供一种同时针对多种生殖道病原体的单管检测方法，其采用上述多重pcr试剂盒，其包括：
17、配制多重pcr反应体系，多重pcr反应体系包括每种生殖道病原体靶基因的模版dna、上游引物、下游引物和荧光探针；
18、经过多重pcr扩增后，进行熔解曲线分析，并根据熔解峰tm值的差异判断靶标基因的基因型。
19、进一步地，上述生殖道病原体包括微小脲原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体、奈瑟淋球菌和单纯疱疹病毒ii型中的至少三种。
20、进一步地，上述所述生殖道病原体以及检测所述生殖道病原体的荧光探针序列如下：
21、奈瑟淋球菌，荧光探针序列为seq id no.3；
22、沙眼衣原体，荧光探针序列为seq id no.6；
23、解脲支原体，荧光探针序列为seq id no.9；
24、微小脲原体，荧光探针序列为seq id no.12；
25、人型支原体，荧光探针序列为seq id no.15；
26、生殖支原体，荧光探针序列为seq id no.18；
27、单纯疱疹病毒ii型，荧光探针序列为seq id no.21。
28、综上所述，本申请具有以下有益效果：
29、(1)本申请采用引物淬灭标记和熔接曲线分析法，利用荧光标记的长链taqman探针与带淬灭基团的引物，实现对靶基因的检测，解决了传统pcr通量低，设计复杂，成本高的问题。
30、(2)本申请提供的这种多重pcr熔解曲线分析方法，灵敏度高、特异性强，能够实现单管多重基因靶标的检测。且能够利用有限的荧光通道单管实现多种病原体检测，突破了荧光pcr检测有限的瓶颈，可广泛用于各种病原体微生物的检测中。
31、(3)本申请提供的检测方法耗时短，效率高，可在1小时内完成对96个样本多种病原体的检测，在临床应用中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于多种靶基因检测的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，所述多重PCR反应体系中，针对每种待测靶基因的引物探针比例为：上游引物：下游引物：探针=2:2:1。
3.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，在进行所述熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：
4.根据权利要求3所述的用于多种靶基因检测的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，在进行所述熔解曲线分析过程中，所述熔解曲线程序中的升温速率和降温速率均为0.04-0.08℃/s。
5.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任一种，所述荧光发光基团选自FAM、HEX、ROX和CY5中的任一种。
6.一种用于单管检测多种靶基因的多重PCR试剂盒，其用于实现如权利要求1~5所述的多重PCR熔解曲线分析方法，其特征在于，其包括：
7
8.根据权利要求7所述的针对多种生殖道病原体的单管检测方法，其特征在于，所述生殖道病原体包括微小脲原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体、奈瑟淋球菌和单纯疱疹病毒II型中的至少五种。
9.根据权利要求8所述的针对多种生殖道病原体的单管检测方法，其特征在于，所述生殖道病原体以及检测所述生殖道病原体的荧光探针序列如下：
...【技术特征摘要】
1.一种用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述多重pcr反应体系中，针对每种待测靶基因的引物探针比例为：上游引物：下游引物：探针=2:2:1。
3.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，在进行所述熔解曲线分析过程中，熔解曲线程序为：
4.根据权利要求3所述的用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，在进行所述熔解曲线分析过程中，所述熔解曲线程序中的升温速率和降温速率均为0.04-0.08℃/s。
5.根据权利要求1所述的用于多种靶基因检测的多重pcr熔解曲线分析方法，其特征在于，所述荧光淬灭基团选...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱怡倩，童京京，赵瑞瑞，刘勋，刘瑞娜，杨伟，
申请(专利权)人：河南省华之源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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