【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，涉及一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法。
技术介绍
1、糖尿病是一种由于机体糖代谢功能受损而产生的疾病，主要包括1型、2型(占所有糖尿病发病人数的90％)和妊娠糖尿病。据数据显示，全球约8％的成年人患有糖尿病，而我国成年人糖尿病患病率高达11％。糖尿病已逐渐成为一种严重威胁人类健康、对社会经济产生巨大负担的慢性疾病。胰岛素作为调控糖代谢的重要激素，其分泌异常会导致机体糖代谢紊乱，进而引发糖尿病。胰岛β细胞是合成和分泌胰岛素的唯一细胞，当β细胞受到葡萄糖、脂肪酸等信号分子作用时，其含有胰岛素的分泌囊泡与细胞膜融合使胰岛素分泌到血液中，进而起到调节机体糖代谢的作用。
2、研究表明，遗传基因、不良的饮食习惯和缺乏运动是糖尿病主要的致病因素。此外，一些有毒有害化合物暴露也是导致糖尿病发病率上升的重要因素之一。毒理机制研究揭示，这些化合物对β细胞产生的胰岛素分泌刺激效应可能会导致β细胞胰岛素分泌功能受损，成为糖尿病发病率上升的关键机制之一。因此，探究化合物对β细胞的胰岛素分泌刺激效应有助于评估化合物引发糖尿病的潜在风险。当前，全球每年新增数百万种化学品，其中有上千种会进入环境并与人体接触。因此，使用成本低、速度快、特异性较好的检测方法进行化合物对β细胞的胰岛素分泌刺激效应检测，可以有效筛选可能具有糖尿病引发风险的化合物，从而对评估化合物对人体健康产生的影响具有重要意义。
3、目前研究化合物对β细胞胰岛素分泌刺激效应的主流方法主要依赖于活体动物实验。该方法通过检测暴露于待测化合物后的活体
4、钙离子是调控胰岛β细胞内胰岛素释放的重要上游信号分子。当葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等化合物作用于β细胞时，会使细胞内钙离子浓度升高，进而刺激胰岛素的分泌。前期有研究者采用钙离子荧光探针的方法证实了诸如全氟化合物等化合物可导致胰岛素瘤胰岛β细胞内钙离子浓度上升，进而导致细胞分泌胰岛素。这些研究结果表明，可以通过检测化合物暴露后胰岛素瘤胰岛β细胞内的钙离子浓度变化来判断化合物是否具有潜在的胰岛素分泌刺激效应。但是现有方法主要基于荧光光谱仪进行钙离子探针荧光信号检测。该过程首先需将细胞在培养皿中进行荧光探针孵育，然后将细胞进行胰酶消化收集。收集后的细胞需置于荧光池子中，加入待测化合物进行荧光信号检测。此方法操作同样较为复杂，且胰酶消化收集过程可能会对β细胞的结构和功能造成损害，导致实验结果不能充分反映真实状态下化合物对β细胞的胰岛素分泌刺激效应。此外，由于荧光光谱仪每次仅能分析一个样品，此种方法无法实现高通量检测，对检测速度造成负面影响。
5、因此有必要提供一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，通过较低成本，较简单的操作实现高通量检测，以更好地满足化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测需求，从而有效、快速筛选可能具有糖尿病引发风险的化合物，评估化合物对人体健康产生的影响。
技术实现思路
1、为了克服
技术介绍
中的问题，本专利技术提出了一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法。基于钙离子是调控胰岛β细胞内胰岛素释放的重要上游信号分子，通过检测胰岛素瘤胰岛β细胞内钙离子浓度的变化，在细胞水平进行化合物对胰岛素潜在分泌刺激效应的高通量检测，以评估化合物潜在的胰岛素分泌刺激效应。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
3、所述的检测方法包括以下步骤：
4、(1)将胰岛素瘤胰岛β细胞接种到96孔板进行细胞培养。96孔板是黑色或者白色透明底细胞培养板。
5、(2)去除96孔板中的细胞培养液，将接种后的胰岛素瘤胰岛β细胞与钙离子荧光探针混合孵育，然后检测孵育后体系的荧光信号，作为背景体系荧光信号。胰岛素瘤胰岛β细胞与钙离子荧光探针在96孔板中进行混合孵育，使用多功能酶标仪检测荧光信号。
6、(3)将待测化合物加入所述步骤(2)的背景体系中，然后检测加入待测化合物后体系的荧光信号，作为含待测化合物体系荧光信号。使用多功能酶标仪检测荧光信号。
7、(4)比较含待测化合物体系荧光信号较背景体系荧光信号是否提高，进而判断化合物是否具有潜在的胰岛素分泌刺激效应。
8、作为优选，所述步骤(1)中，胰岛素瘤胰岛β细胞接种的细胞密度为30000～100000个/孔。
9、作为优选，所述钙离子荧光探针包括fluo-4,am、fluo-5f,am、fluo-4ff,am探针中的一种。
10、作为优选，其特征在于：所述钙离子荧光探针浓度为1～5μmol/l。
11、作为优选，所述步骤(2)中孵育条件为在37℃条件下避光孵育30～60min。
12、作为优选，所述步骤(3)中，待测化合物浓度为1～100μmol/l。
13、作为优选，所述步骤(4)中，对含待测化合物体系荧光信号与背景体系荧光信号采用t-test进行显著性差异分析。当p值小于0.05时，即表明含待测化合物体系荧光信号与背景体系荧光信号相比，具有显著差异，说明待测化合物对β细胞内钙离子浓度产生影响，进而确定化合物具有潜在的胰岛素分泌刺激效应。
14、本专利技术的有益效果：
15、(1)本专利技术方法通过在细胞水平检测化合物暴露后细胞内钙离子浓度的变化来判断化合物是否具有潜在的胰岛素分泌刺激效应，特异性好、操作流程简洁，可以实现高通量检测，有利于提高检测速度。
16、(2)本专利技术方法仅需使用普通多功能酶标仪完成检测，有利于降低实验成本，提高本专利技术方法适用范围。
17、(3)基于本专利技术方法，可以为评估化合物对人体健康产生的影响提供重要支撑，应用价值较高。
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1.一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：通过检测胰岛素瘤胰岛β细胞内钙离子的浓度变化，在细胞水平进行化合物对胰岛素潜在分泌刺激效应的高通量检测，所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，胰岛素瘤胰岛β细胞接种的细胞密度为30000～100000个/孔。
3.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述钙离子荧光探针包括Fluo-4,AM、Fluo-5F,AM、Fluo-4FF,AM探针中的一种。
4.根据权利要求1或3任一项所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述钙离子荧光探针浓度为1～5μmol/L。
5.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中孵育条件为在37℃条件下避光孵育30～60min。
6.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，待测化合物浓度为1～1
7.根据权利要求1所述的一种化合物对对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，对含待测化合物体系荧光信号与背景体系荧光信号采用T-test进行显著性差异分析。
...【技术特征摘要】
1.一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：通过检测胰岛素瘤胰岛β细胞内钙离子的浓度变化，在细胞水平进行化合物对胰岛素潜在分泌刺激效应的高通量检测，所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，胰岛素瘤胰岛β细胞接种的细胞密度为30000～100000个/孔。
3.根据权利要求1所述的一种化合物对胰岛素分泌刺激效应的检测方法，其特征在于：所述钙离子荧光探针包括fluo-4,am、fluo-5f,am、fluo-4ff,am探针中的一种。
4.根据权利要求1或3任一项所...
【专利技术属性】
技术研发人员：任肖敏，张萍萍，赵粉青，胡辉翔，潘学军，何欢，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
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