【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种用于单细胞测序的蜜蜂咽下腺单细胞悬液的制备方法。
技术介绍
1、单细胞测序是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术，能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。进行单细胞测序前，先要对样本进行解离，制备符合上机要求的高质量单细胞悬液，如果方法不当，细胞的基因表达谱将会出现变化，影响单细胞数据的质量。
2、蜂王浆是由蜜蜂工蜂咽下腺和上颚腺共同分泌的一种乳白色或淡黄色有粘性的浆状物质，是用来饲喂蜂王和3日龄内幼虫的高营养食物。蜂王浆含有丰富的蛋白质和脂肪酸等活性成分，被广泛应用于食品、医药和日化等领域，是深受消费者喜爱的蜂产品。蜂王浆蛋白质不仅在蜂群中对蜜蜂分化起到关键性作用，还具有抗氧化、抗炎和延缓衰老等维持人体健康的重要作用。咽下腺是合成蜂王浆蛋白质的主要腺体，在蜜蜂生长阶段表现出不同的生物功能，在哺育阶段主要合成蜂王浆蛋白。因此，对咽下腺细胞的异质性的研究为理解王浆蛋白合成和分泌的分子机制提供更准确的信息，进而为高效生产优质蜂王浆提供理论基础。
3、蜜蜂咽下腺的主导管上连接着数百根支导管和腺泡，腺泡中包含8-12个不同类型的细胞，如王浆分泌细胞、酶原细胞、壁细胞，腺泡外有一层0.1-0.2μm结缔组织膜。基于咽下腺的组成结构，研发了咽下腺组织消化解离制备单细胞悬液的方案。采用本专利技术消化解离咽下腺，实验结果发现制备的单细胞样本质量符合单细胞测序的要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种
2、(1)咽下腺组织清洗：
3、将解剖取出的蜜蜂咽下腺样本浸没在保存液中，静置后将上清液全部弃去，加入10％fbs后混匀，静置后弃去上清，重复清洗2次；
4、(2)酶消化处理：
5、向步骤(1)清洗后的组织中加入足量酶解离溶液进行消化，酶解结束后在管中加入10％fbs终止消化，得到腺体细胞混合液；
6、(3)杂质过滤：
7、将步骤(2)中腺体细胞混合液静置，吸取上清通过细胞筛进行过滤，用10％fbs清洗细胞筛，得到细胞悬液；
8、(4)细胞清洗：
9、将步骤(3)中收集得到的细胞悬液离心，弃去上清，用10％fbs重悬再次离心；再次用10％fbs重悬，得到最终的单细胞悬液。
10、(5)细胞观察与质检：
11、吹匀步骤(4)中得到的单细胞悬液，取部分细胞悬液置于细胞计数板中，加入ao/pi染色，观察细胞，并计算细胞活性、细胞浓度。
12、步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中10％fbs溶液均为用fbs和1×pbs按1：9混合配置，放置在冰上预冷。
13、步骤(1)中，所取意大利蜜蜂放置在4℃冰箱冷冻麻醉20-30min左右，以蜜蜂不再动弹为准，从冰箱取出的活体蜜蜂放置在冰上，在解剖咽下腺过程中滴加预冷的pbs保持腺体湿润。步骤(1)中，所述保存液为美天旎组织保存液。
14、步骤(2)中，所述酶解离溶液为用等体积的1×pbs和0.25％trypsin-edta胰酶配置的0.5×胰酶，并提前置于恒温水浴锅恢复至37℃，加入体积为2ml；所述消化条件为：消化温度为室温，消化时间为3min，消化期间可用1ml移液器轻柔吹打2-3次，增加组织解离的程度，但不可过于剧烈，会致使大量细胞死亡。如果不使用移液器吹打，可能组织无法充分解离。步骤(2)中，所述10％fbs体积为与加入酶解离溶液体积相同。
15、步骤(3)中，所述过滤用细胞筛为70μm和30μm两种孔径的细胞筛；所述清洗用10％fbs体积为2ml。
16、若步骤(2)中得到的腺体细胞混合液中仍剩余较多未解离组织，则重复步骤(2)和步骤(3)一次。
17、步骤(4)中，所述离心条件均为：离心转速为500g，离心温度为4℃，离心时间为5min；所述第一次10％fbs体积为6ml，第二次10％fbs体积为100-200μl，根据细胞沉淀量决定。
18、本专利技术的另一个目的是提供所述方法在蜜蜂咽下腺单细胞测序中应用。
19、与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：
20、本专利技术提供了一种用于蜜蜂咽下腺单细胞悬液的制备方法，第一次将蜜蜂咽下腺单细胞进行分离，分离获得的具有高细胞活性、高细胞数的蜜蜂咽下腺单细胞悬液用于单细胞测序有良好的效果。本专利技术方法具有细胞总量多、活率高的优点，可在单细胞测序中应用。本专利技术填补了制备蜜蜂咽下腺单细胞悬液方面的空缺。
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1.一种用于单细胞测序的蜜蜂咽下腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中10％FBS溶液均为用FBS和1×PBS按1：9混合配置，放置在冰上预冷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所取意大利蜜蜂放置在4℃冰箱冷冻麻醉20-30min，以蜜蜂不再动弹为准，从冰箱取出的活体蜜蜂放置在冰上，在解剖咽下腺过程中滴加预冷的PBS保持腺体湿润，所述保存液为美天旎组织保存液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解离溶液为用等体积的1×PBS和0.25％Trypsin-EDTA胰酶配置的0.5×胰酶，并提前置于恒温水浴锅恢复至37℃，加入体积为2mL；所述消化条件为：消化温度为室温，消化时间为3min；所述10％FBS体积为与加入酶解离溶液体积相同。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述过滤用细胞筛为70μm和30μm两种孔径的细胞筛；所述清洗用10％FBS。>
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，当步骤(2)中得到的腺体细胞混合液中仍剩余较多未解离组织时，则重复步骤(2)和步骤(3)一次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心条件为：离心转速为500g，离心温度为4℃，离心时间为5min；所述第一次10％FBS体积为6mL，第二次10％FBS体积为100-200μL。
...【技术特征摘要】
1.一种用于单细胞测序的蜜蜂咽下腺单细胞悬液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中10％fbs溶液均为用fbs和1×pbs按1：9混合配置，放置在冰上预冷。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所取意大利蜜蜂放置在4℃冰箱冷冻麻醉20-30min，以蜜蜂不再动弹为准，从冰箱取出的活体蜜蜂放置在冰上，在解剖咽下腺过程中滴加预冷的pbs保持腺体湿润，所述保存液为美天旎组织保存液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶解离溶液为用等体积的1×pbs和0.25％trypsin-edta胰酶配置的0.5×胰酶，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，胡云霄，胡福良，郑火青，卢媛媛，黄凯靓，郑秋岚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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