【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法及其应用，属于基因工程和酶工程。
技术介绍
1、褐藻胶主要是从褐藻类植物的细胞壁及细胞间质中提取出来的具有一定粘性的线性多糖，由两个同分异构单体β-d-甘露糖醛酸(m)和α-l-古洛糖醛酸(g)通过α,β-(1,4)-糖苷键随机排列形成，主要产物种类有均聚甘露糖醛酸(poly-m)、均聚古洛糖醛酸(poly-g)以及m和g随机组合的杂聚物(poly-mg、poly-gm)。褐藻胶低聚糖为褐藻胶水解后形成的聚合度为2-25的低聚物，与褐藻胶相比褐藻胶低聚糖平均分子量小、粘度低、水溶性好，克服了褐藻胶应用时的诸多不足。有研究表明褐藻胶低聚糖是一种益生元，具备多种生理活性，如抗氧化、抗菌、免疫调节以及促进植物生长等活性功能，在医药、食品、农业等领域具有极大的应用潜力。褐藻胶低聚糖是一种海洋来源的功能性低聚糖，是目前的研究热点，值得深入研究和开发。
2、目前褐藻胶的降解方法有3种，分别为物理降解法、化学降解法和生物降解法。在这些方法中，物理法通常操作简单，环境污染小，反应速度快，但无法将褐藻胶完全降解，原料利用率低，同时存在能耗大等不足；化学法一般成本较低，但反应步骤复杂，耗时久，存在多方面缺陷，包括：所用试剂可能腐蚀设备，污染环境，产物存在安全性隐患，以及产物为饱和的褐藻胶低聚糖，褐藻胶低聚糖的活性受到一定破坏等；而生物法集催化效率高，底物专一性强，反应条件温和，产物得率高，节能环保等优点于一体。因此，利用生物酶法降解褐藻胶成为目前的研究热点。
3、然而，天然的褐
4、现有技术当中，有通过基因工程技术提高褐藻胶裂解酶的热稳定性：
5、例如，zhou，meng和zhang等人通过综合策略包括序列分析，结构分析及计算机辅助δδg数值计算对来源于pseudomonas mendocina的褐藻胶裂解酶pmd进行定点突变，得到5个单点突变体a74i，a74v，g75v，a240v和d250g，它们的tm值与野生型相比分别提高了3.15℃，3.94℃，5.21℃，2.56℃和4.8℃，然后按照δtm大小进行组合得到tm值进一步提高的突变体m2(g75v-d250g)，m3(g75v-d250g-a74v)，m4(g75v-d250g-a74v-a240v)，tm分别提高了6.88℃，8.07℃和9.34℃。(licheng zhou,meng q,zhang r,et al.improvingthermostability of a pl5 family alginate lyase with combination of rationaldesign strategies[j].international journal of biological macromolecules,2023.)；zhang，li和pan等人对来源于flavobacterium sp.umi-01的褐藻胶裂解酶flalya利用计算机辅助计算b因子和自由能变化构建突变体，得到了tm提高0.35℃的突变体h71d和tm提高1.26℃的突变体h176k，并且突变体h176k在50℃时半衰期几乎为野生型的两倍。(zhang x,li w,pan l,et al.improving the thermostability of alginate lyaseflalya with high expression by computer-aided rational design for industrialpreparation of alginate oligosaccharides[j].frontiers in bioengineering andbiotechnology,2022,10.)；yang，liu和li等人通过合理设计将二硫键引入来自microbulbifersp.q7的褐藻胶裂解酶calym，以提高其热稳定性，最终得到突变体d102c-a300c的tm提高了1.7℃，突变体g103c-t113c的tm提高了0.4℃，并且突变体d102c-a300c在55℃的半衰期约为calym的1.9倍，催化效率约为calym的1.494倍。(yang m,yang s,liu z,et al.rational design of alginate lyase from microbulbifer sp.q7 to improvethermal stability[j].marine drugs,2019,17(6):378.)。
6、但目前工业化生产大多在高温条件下进行，现有的褐藻胶裂解酶还无法在高温环境下长时间保持较好的活性和稳定性，无法满足工业化生产条件。因此，开发高耐热性的褐藻胶裂解酶将显著提升褐藻胶裂解酶的工业应用价值，有助于降低工业化生产褐藻胶低聚糖的成本，推广酶法制备褐藻胶低聚糖，实现海洋资源的高值化利用。
技术实现思路
1、[技术问题]
2、褐藻胶在室温下溶解度低，高浓度的褐藻胶溶液室温下溶液粘度高，不利于酶解反应的进行。在高温下能增强褐藻胶的溶解度并降低褐藻胶溶液的黏度，有利于褐藻胶裂解酶与底物充分接触反应，提高催化效率。然而，现有的褐藻胶裂解酶热稳定性较差，并不能够满足工业化生产褐藻胶低聚糖时间长、温度高的要求，使得褐藻胶裂解酶实际工业应用受到较大限制。
3、[技术方案]
4、专利技术人前期通过对已经解析晶体结构的不同来源、水解褐藻胶得到不同产物的褐藻胶裂解酶进行文献调研，发现来源于psychromonas sp.c-3的内切型褐藻胶裂解酶alyc3(ncbi登录号：qop59290)，已解析晶体结构(pdb：7c8g)，主要产物为甘露糖醛酸三糖。
5、本专利技术经对来源于psychromonas sp.c-3的野生型褐藻胶裂解酶alyc3及本专利技术的突变体表征后，发现单一点突变体极大的提高了褐藻胶裂解酶的耐热性，其表观熔融温度(tm)最多提高了11.24℃，经过单点组合后得到组合突变体，其表观熔融温度(tm)最多提高了17.05℃，与目前已报导提高褐藻胶裂解酶热力学热稳定性文章相比，提高显著，所有突变体最适温度提高了10℃，单一点突变体t1/2最多提高1.66倍，经过单点组合后得到组合突变体t1/2最多提高8.21倍，同时全部突变体的酶活没有明显损失，部突变体酶活分略有提高，这些特性有助于提高工业化生产中褐藻胶原料的利用率，提高褐藻胶低聚糖的生产效率，降低生产成本，增加褐藻胶低聚糖的产量，赋予褐藻胶裂解酶更大的工业化应用价值，有助于海洋资源的开发利用。
6、本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶突变体对氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的序列进行了如下至少一处氨基酸的取代：
2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体的基因。
3.表达权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体或权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。
5.表达权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体，或含有权利要求2所述基因，或含有权利要求3或4所述的重组载体的重组细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
7.一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的褐藻胶裂解酶的第18位苏氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQID NO.4所示的褐藻胶裂解酶的第34位丙氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示的褐
8.含有权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体的组合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物以权利要求1所述褐藻胶裂解酶作为主要酶组分，并含有一种或多种佐剂，所述佐剂包括但不限于酶稳定剂。
10.权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3或4所述的重组载体，或权利要求5或6所述重组细胞在水解褐藻胶或制备含有褐藻胶三糖的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶突变体对氨基酸序列如seq id no.4所示的序列进行了如下至少一处氨基酸的取代：
2.编码权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体的基因。
3.表达权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体或权利要求2所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为pet系列、duet系列、pgex系列、phy300、phy300plk、ppic3k或ppic9k系列载体。
5.表达权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体，或含有权利要求2所述基因，或含有权利要求3或4所述的重组载体的重组细胞。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。
7.一种提高褐藻胶裂解酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如seq id no.4所示的褐藻胶裂解酶的第18位苏氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seqid no.4所示的褐藻胶裂解酶的第34位丙氨酸突变为脯氨酸；或将氨基酸序列如seq idno.4所示的褐藻胶裂解酶的第73位天冬酰胺突变为甘氨酸；...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙杰，陈晨，李兴飞，田耀旗，周星，陈龙，邱超，焦爱权，金征宇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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