【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶催化领域，具体涉及一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。
技术介绍
1、乳果糖是d-半乳糖和d-果糖通过β-1,4糖苷键连接生成的功能性二糖，甜度约为蔗糖的48％～62％。研究表明，乳果糖的β-糖苷键不能被哺乳动物体内的消化酶水解，因此无法被人体吸收，但可以促进肠道内双歧杆菌等益生菌生长，抑制有害微生物的生长，有效地保证了胃肠道生态系统的平衡，可有效地缓解便秘，提高免疫力；乳果糖能够维持血糖和胰岛素水平，可用作药物辅助治疗糖尿病；可降低肝脑患者的血氨浓度，缓解肝病患者病情。
2、乳果糖的生产方法主要有化学异构法和生物酶转化法。目前商业化的乳果糖主要是在碱性条件下通过化学异构乳糖法制备。化学法制备乳果糖不仅副产物高，还给后续分离纯化带来困难，另外酸碱的使用也会给生产带来安全的风险和环境污染。
3、生物酶转化法生产乳果糖相比较于化学法生产的反应条件温和，不需要添加大量的化学试剂，不需要考虑金属离子的分离问题，同时在生产中不会造成环境污染，产品更容易为市场所接受。目前生物酶法主要有β-半乳糖苷酶和纤维二糖差向异构酶。β-半乳糖苷酶以乳糖和果糖作为底物，将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，之后通过转糖苷功能使半乳糖基团通过缩合果糖形成乳果糖，终产物一般包括乳果糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和乳糖，乳果糖的得率较低，杂糖多，分离纯化难度大，成本较高，工业化潜力不高。纤维二糖差向异构酶(cease)能够以乳糖为唯一底物，催化β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖残基异构化为果糖残基
4、现有技术中降低依匹乳糖含量的方法主要有提高反应温度、在反应体系中加入硼酸、精制发酵液等。但提高反应温度可以提高乳果糖的产率，但仅依靠提高反应温度，目前酶法生产乳果糖的依匹乳糖含量仍达不到药典规定的标准(含量低于10％)，因此仍需结合其他手段来降低依匹乳糖含量；而硼是禁止在食品中添加的成分，精制的手段则增加了生产程序，导致生产成本增加。基于上述原因，目前的酶法生产乳果糖尚未实现大规模工业化。
5、此外，生物酶转化法常采用游离酶作为催化剂，存在难以回收、难以分离且热稳定性较差等问题，会显著增加生产成本。利用固定化技术将酶固定在载体上，可增强酶的使用和储存稳定性，达到生物催化剂循环利用，易于分离纯化，简化后处理工艺，降低生产。
6、酶的固定化包括吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。共价结合法是以共价结合方式将酶固定到一个合适的载体，该法的连接强度较高，可使酶在固定化体系中漏出更少，保证固定化酶具有良好的操作稳定性。但共价结合法固定化反应较激烈，会造成酶活性下降，因此酶固定化载体和方法选择尤为重要。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的问题，本专利技术提供一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法及其应用，不仅能够实现对乳果糖的高转化率，还能同时降低依匹乳糖的含量至允许比例，有利于工业应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法，包括如下步骤：
4、(1)制备待固定酶液：将含有纤维二糖差向异构酶编码基因的重组基因工程菌超声破碎、离心得到粗酶液，向所述粗酶液中加入甘油、海藻糖和谷氨酸，混匀，形成待固定酶液；所述甘油的终浓度150～300g/l，所述海藻糖的终浓度15～25g/l，所述谷氨酸的终浓度40～60g/l；
5、所述纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列为seq id no.2；
6、(2)对氨基树脂进行预处理；
7、(3)酶的固定化：步骤(2)中预处理后的氨基树脂与步骤(1)得到的待固定酶液接触12～24h，优选为16h，之后洗涤，获得纤维二糖差向异构酶固定化酶；所述待固定酶液与所述氨基树脂的体积质量比为3～9ml/g。
8、优选的，步骤(1)中所述重组基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
9、优选的，步骤(1)中所述粗酶液的制备方法为：将所述重组基因工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬于ph6.0～7.0的缓冲溶液中，超声破碎后收集上清液，即得所述粗酶液。
10、优选的，所述缓冲溶液为nah2po4-na2hpo4或pbs缓冲溶液。更优选为ph6.5的pbs缓冲溶液。
11、优选的，步骤(2)中所述预处理的方法为：将氨基树脂按照质量体积比1:10的比例加入0.1m ph8.0的缓冲溶液中，在25℃，ph7.0～8.5范围内水浴搅拌1～1.5h后过滤抽干，再将滤饼按照质量体积比1:5的比例加入2％wt，ph7.8～8.2的戊二醛磷酸缓冲液中，25℃搅拌1h，过滤、用去离子水洗涤至水清，之后去除氨基树脂表面的水。
12、优选的，步骤(3)中，将所述氨基树脂与所述待固定酶液在25～28℃条件下接触。
13、优选的，步骤(3)中所述的洗涤的方法为，先用2％的nacl溶液洗涤，再用去离子水洗涤。
14、优选的，步骤(3)中所述的体积质量比为7ml/g。
15、优选的，所述氨基树脂为氨基树脂evx。氨基树脂evx为现有技术，可购自西安蓝晓科技有限公司。
16、本专利技术还提供上述方法获得的纤维二糖差向异构酶固定化酶在制备乳果糖中的应用，包括如下步骤：
17、以所述纤维二糖差向异构酶固定化酶为催化剂，以乳糖为催化底物，在75～85℃，优选82℃、ph6.0～7.0，优选ph6.5下转化。
18、优选的，所述应用还包括转化后在12000rpm、4℃离心10min，抽滤回收固定化酶的步骤。
19、通过hplc检测，采用本专利技术制得的纤维二糖差向异构酶固定化酶，得到的乳果糖含量为350.5g/l，纤维二糖差向异构酶固定化酶催化乳糖生成乳果糖产率为70.1％，依匹乳糖产率为8.1％。
20、与现有技术相比较，本专利技术的有益效果主要体现在：
21、(1)本专利技术制备的纤维二糖差向异构酶固定化酶具有明显的优势，固定化酶的最适酶反应温度较游离酶提高了7℃，底物乳糖浓度提高至500g/l，乳果糖产率最高达到70.5％，乳果糖产率高的同时依匹乳糖的产率仅为8.1％，远远低于中国药典所允许的比例。
22、(2)本专利技术首次在纤维二糖差向异构酶固定化过程中采用海藻糖作为酶蛋白活性中心的保护剂，使固定化酶具有较高的活性和稳定性。海藻糖性质稳定，具有耐热耐酸特性，协同多羟基化合物甘油和谷氨酸，通过提高酶蛋白溶液的粘度、增加表面张力及与酶蛋白发生共价作用，稳定酶蛋白质的三维结构，从而保护酶蛋白质分子的活性中心，避免了固定化过程中酶分子严重失活的情况下成功地将纤维二糖差向本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述重组基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述粗酶液的制备方法为：将所述重组基因工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬于pH6.0~7.0的缓冲溶液中，超声破碎后收集上清液，即得所述粗酶液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为NaH2PO4-Na2HPO4或PBS缓冲溶液；优选为pH6.5 PBS缓冲溶液。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述预处理的方法为：将氨基树脂按照质量体积比1:10的比例加入0.1M pH8.0的缓冲溶液中，在25℃，pH7.0～8.5范围内水浴搅拌1～1.5 h后过滤抽干，再将滤饼按照质量体积比1:5的比例加入2%wt，pH7.8~8.2的戊二醛磷酸缓冲液中，25℃搅拌1 h，过滤、用去离子水洗涤至水清，之后去除氨基树脂表面的水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的洗涤的方法为，先用2%的NaCl溶液洗涤，再用去离子水洗涤。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的体积质量比为7mL/g。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基树脂为氨基树脂EVX。
10.权利要求1-9任一所述的方法获得的纤维二糖差向异构酶固定化酶在制备乳果糖中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种固定化纤维二糖差向异构酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述重组基因工程菌以大肠杆菌为宿主菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述粗酶液的制备方法为：将所述重组基因工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬于ph6.0~7.0的缓冲溶液中，超声破碎后收集上清液，即得所述粗酶液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为nah2po4-na2hpo4或pbs缓冲溶液；优选为ph6.5 pbs缓冲溶液。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述预处理的方法为：将氨基树脂按照质量体积比1:10的比例加入0.1m ph8.0的缓冲溶液中，在25℃，ph7.0～8.5范围内水浴搅拌1...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐斌，齐曼婷，王立梅，王玉华，
申请(专利权)人：苏州科曼多生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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