【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及蛋白质工程领域，具体涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及应用。
技术介绍
1、乳果糖是d-半乳糖和d-果糖通过β-1,4糖苷键连接生成的功能性二糖，甜度约为蔗糖的48%-62%。研究表明，乳果糖的β-糖苷键不能被哺乳动物体内的消化酶水解，因此无法被人体吸收，但可以促进肠道内双歧杆菌等益生菌生长，抑制有害微生物的生长，有效地保证了胃肠道生态系统的平衡，可有效地缓解便秘，提高免疫力；乳果糖能够维持血糖和胰岛素水平，可用作药物辅助治疗糖尿病；可降低肝性脑患者的血氨浓度，缓解肝性脑病患者病情。
2、乳果糖的生产方法主要有化学异构法和生物酶转化法。目前商业化的乳果糖主要是在碱性条件下通过化学异构乳糖法制备。化学法制备乳果糖需要强碱条件，不仅副产物多，脱盐复杂，造成获得高纯度的乳果糖相对困难且不符合绿色生产的大趋势。
3、生物酶转化法生产乳果糖相比较于化学法生产的反应条件温和，不需要添加大量的化学试剂，不需要考虑金属离子的分离问题，同时在生产中不会造成环境污染，产品更容易为市场所接受。目前生物酶法主要有β-半乳糖苷酶和纤维二糖差向异构酶(cease)。β-半乳糖苷酶以乳糖和果糖作为底物，将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，之后通过转糖苷功能使半乳糖基团通过缩合果糖形成乳果糖，终产物一般包括乳果糖、葡萄糖、半乳糖、果糖和乳糖，乳果糖的得率较低，杂糖多，分离纯化难度大，成本较高，工业化潜力不高。纤维二糖差向异构酶能够以乳糖为唯一底物，催化β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖残基异构化为果糖残基从而生成乳果
4、现有技术中降低依匹乳糖含量的方法主要有提高反应温度、在反应体系中加入硼酸、精制发酵液等。但提高反应温度可以提高乳果糖的产率，但仅依靠提高反应温度，目前酶法生产乳果糖的依匹乳糖含量仍达不到药典规定的标准（含量低于10%），因此仍需结合其他手段来降低依匹乳糖含量；而硼是禁止在食品中添加的成分，精制的手段则增加了生产程序，导致生产成本增加。基于上述原因，目前的酶法生产乳果糖尚未实现大规模工业化。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是将纤维二糖差向异构酶的第227位亮氨酸突变为缬氨酸后得到；
2、所述纤维二糖差向异构酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3、本专利技术的第二目的在于提供编码上述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。
4、本专利技术的第三目的在于提供含有上述编码基因的表达载体。
5、作为一种优选的实施方式，所述表达载体为pet28a（+）。
6、本专利技术的第四目的在于提供含有上述表达载体的重组工程菌。具体的，将突变体编码基因导入表达载体后得到的重组表达质粒转入宿主细胞，得到所述重组工程菌。
7、作为一种优选的实施方式，所述重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌构建。
8、本专利技术的第五目的在于提供上述纤维二糖差向异构酶突变体在发酵产乳果糖中的应用。
9、作为一种优选的实施方式，以所述纤维二糖差向异构酶突变体为催化剂，以乳糖为底物，在75～80℃条件下进行转化反应。
10、作为一种优选的实施方式，所述纤维二糖差向异构酶突变体以纯酶或粗酶液的形式作为催化剂；
11、所述粗酶液的制备方式为：以所述纤维二糖差向异构酶突变体为目的基因构建重组工程菌，将所述重组工程菌经诱导培养后收集湿菌体，将湿菌体重悬、超声破碎后收集上清液，即粗酶液。优选使用粗酶液，纯化酶的过程很繁琐，且纯酶得率低，纯化过程中酶活力下降较多，工业化只需要粗酶液即可。
12、作为一种优选的实施方式，底物乳糖浓度为100～400g/l。
13、作为一种优选的实施方式，酶用量为16～25u/g乳糖。
14、作为一种优选的实施方式，转化反应的条件为ph6.0～7.0（优选ph6.5）、100～200rpm下反应5～10h （优选6h），制得乳果糖。
15、本专利技术所述纤维二糖差向异构突变体是通过对rhodothermus marinus的纤维二糖差向异构酶进行单个氨基酸突变，提高其催化乳糖异构形成乳果糖的能力。首先将纤维二糖差向异构酶编码基因（seq id no.2）与表达载体pet28a（+）连接，构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化到e.coli bl21(de3)中。以含有纤维二糖差向异构酶基因的重组表达质粒为模板，通过定点突变及时进行基因改造，然后将重组表达质粒转化到e.colibl21(de3)中。得到含有纤维二糖差向异构酶突变体基因的e.coli bl21(de3)基因工程菌。对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有纤维二糖差向异构酶突变体的菌体细胞，菌体经过破碎、离心获得粗酶液，将突变体酶和原始酶进行催化活性比较，筛选得到催化性能优异的突变体。
16、作为一种优选的实施方式，所述湿菌体的制备方式为：将重组工程菌接种至含有终浓度50µg/ml卡那霉素的lb液体培养基，于37℃，200rpm下培养10～12h，再按3%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50µg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，于37℃，200rpm下培养至od6000.6～0.8，加入终浓度为0.1mm的iptg，30℃诱导培养12h，4℃、10000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得湿菌体。
17、作为一种优选的实施方式，所述粗酶液的制备方法为：将所述湿菌体按比例悬浮于ph6.0～6.5 pbs缓冲液（优选ph6.3）中，利用超声波破碎，释放细胞内酶蛋白，破碎程序为：冰浴条件下破碎时间2s，间隔时间2s，功率为650w，总破碎时间为30min。细胞破碎液于10000rpm，离心20min，取上清液于70℃下处理30min,然后于10000rpm，离心20min，收集上清液即为纤维二糖差向异构酶粗酶。
18、本专利技术对现有纤维二糖差向异构酶进行定点突变，极大限度地提高天然酶的催化性能，得到的突变体乳果糖转化率高的同时依匹乳糖产率低，在优化体系下，以重组菌的粗酶液为催化剂，以乳糖为底物，转化乳糖至乳果糖的转化率达到70%～73.3%，而依匹乳糖产率仅为7～10%，低于中国药典所允许的副产物比例，具备大规模应用的潜力，在乳果糖的工业化生产中具有极高的应用价值。
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1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将纤维二糖差向异构酶的第227位亮氨酸突变为缬氨酸后得到；
2.编码权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的重组工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌构建。
6.权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体在发酵产乳果糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以所述纤维二糖差向异构酶突变体为催化剂，以乳糖为底物，在75～80℃条件下进行转化反应。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述纤维二糖差向异构酶突变体以纯酶或粗酶液的形式作为催化剂；
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，底物乳糖浓度为100～400g/L。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，酶用量为16～25U/g乳糖。
【技术特征摘要】
1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将纤维二糖差向异构酶的第227位亮氨酸突变为缬氨酸后得到；
2.编码权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的重组工程菌。
5.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌构建。
6.权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体在发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐斌，齐曼婷，王立梅，王玉华，
申请(专利权)人：苏州科曼多生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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