【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因及构建方法与应用，属于生物工程。
技术介绍
1、微生物发酵是目前工业生产l-赖氨酸的唯一方法，高产菌株的高通量选育成为行业的关注重点。目前广泛用于l-赖氨酸工业生产的大多数菌株都是通过诱变育种方法、筛选营养缺陷型菌株或对诱变处理的菌株使用l-赖氨酸结构类似物筛选获得的。结构类似物可能会干扰正常细胞生长，突变体可能无法在突变以及结构类似物的影响下存活。目前，利用l-赖氨酸结构类似物氨基乙基半胱氨酸经过物理或化学诱变能够构建大容量的、包含正负突变的l-赖氨酸菌株突变库。因此，需要一种能够广泛应用于不同种类微生物细胞的筛选标记，用于l-赖氨酸生产菌株的高通量筛选。
2、l-赖氨酸生产菌的高通量筛选依赖于荧光信号，将检测到的荧光信号数字化，这些数字用于分析细胞的荧光特性，例如荧光强度的分布、荧光峰值的位置和形状等。通常，可采用如下方法使细胞携带荧光信号：荧光染料染色、表达荧光蛋白和添加荧光标记底物。常用荧光染料包括小分子有机染料、量子点、藻胆蛋白和荧光示踪染料(核酸染料、细胞质染料和膜结合染料)等。细胞表达的不外泌荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(bfp)、青色荧光蛋白(cfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)及其各种衍生物，如egfp、super-folder gfp、ecfp和eyfp等。
3、关于通过荧光蛋白标记的应用方法报道较多，中国专利文献cn 115725628b公开了一种内含肽偶联荧光蛋白质粒体系和基于微
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，提供一种荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因及构建方法与应用，用于l-赖氨酸生产突变菌的高效筛选。
2、一种用于l-赖氨酸生产菌筛选的荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3、上述荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因的构建方法，包括如下步骤：
4、通过ncbi数据库查找荧光蛋白基因staygold的核苷酸序列，核苷酸序列如seq idno.1所示，并且从大肠杆菌(escherichia coli)cgmcc 1.366基因组中筛选基因rpb，基因rpb的核苷酸序列如seq id no.2所示，并将其中全部的l-赖氨酸的密码子使用密码子aaa替换，通过柔性连接肽将片段与staygold荧光蛋白基因连接并合成获得staygold-rpbr基因片段，核苷酸序列如seq id no.3所示，得到荧光蛋白筛选标记。
5、根据本专利技术优选的，上述方法包括如下步骤：
6、(1)通过ncbi数据库查找荧光蛋白基因staygold的核苷酸序列，核苷酸序列如seqid no.1所示，从大肠杆菌(escherichia coli)cgmcc 1.366基因组中筛选基因rpb，基因rpb的核苷酸序列如seq id no.2所示，并将其中l-赖氨酸的密码子使用稀有密码子aaa替换；
7、(2)通过柔性连接肽将片段连接并合成获得staygold-rpbr基因片段，核苷酸序列如seq id no.3所示；
8、(3)通过无缝克隆将staygold-rpbr片段插入线性化载体质粒，制得重组质粒，经无缝克隆、转化及筛选，即得荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因。
9、根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，载体质粒线性化使用fastdigest ndei、fastdigest bamhi双酶切体系，双酶切反应条件如下：
10、37℃反应30min；80℃失活5min，4℃保存。
11、根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，所述的无缝克隆程序如下：
12、重组反应，50℃，15min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
13、根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，重组质粒转化步骤如下：
14、取重组产物10μl，加入大肠杆菌感受态细胞中，混合，于冰上静置30min，42℃水浴中热激90s，立即置于冰上静置2～3min，向离心管中加入900μl不含抗性的lb培养基，并于37℃，200r/min的摇床中孵育1h，将孵育后的菌液5000r/min离心2min，弃900μl上清液后，将剩余菌体重悬并使用无菌涂布棒均匀涂布于相应抗性的固体lb平板上，将平板于37℃恒温培养箱内倒置培养12～16h，筛选，即得荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因。
15、上述荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因在l-赖氨酸高产菌株高通量筛选中的应用。
16、有益效果
17、本专利技术提供了一种用于l-赖氨酸生产菌筛选的荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因，及该片段的构建方法，本专利技术提供的筛选标记相对于只包含单一荧光蛋白egfp的筛选标记，能够明显提高l-赖氨酸高产菌株的筛选效率，该筛选标记节约筛选时间、成本，并且可以提高筛选效率。
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1.一种用于L-赖氨酸生产菌筛选的荧光蛋白筛选标记staygold-rpBr基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记staygold-rpBr基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，载体质粒线性化使用FastDigest NdeI、FastDigest BamHI双酶切体系，双酶切反应条件如下：
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述的无缝克隆程序如下：
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，重组质粒转化步骤如下：
7.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记staygold-rpBr基因在L-赖氨酸高产菌株高通量筛选中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种用于l-赖氨酸生产菌筛选的荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
2.权利要求1所述荧光蛋白筛选标记staygold-rpbr基因的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，载体质粒线性化...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊卿，杨翠平，高昇，刘月涵，吴静雯，孙初颖，王瑞明，李丕武，王婷，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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