【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物模型，且特别涉及一种神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用。
技术介绍
1、satb2(special at-rich sequence-binding protein 2)属于satb家族，位于小鼠1号染色体，位于人类2号染色体，二者高度同源。satb2蛋白作为与核基质附着区(mar)结合的转录因子，其具有5个转录本，可以激活多个基因的转录。同时，satb2也是几个基因调控网络的高级调控者，在多个发育过程中具有关键作用。近年来的研究表明了satb2在大脑皮层干细胞、祖细胞的分化和增殖过程中起重要的调控作用。神经系统发育过程中，satb2蛋白可以使轴突延伸至胼胝体，确保大脑半球间神经冲动信号得以协同传递；同时，satb2蛋白也影响味觉形成以及长期记忆形成过程，故而研究其调控途径十分重要。
2、9130024f11rik(riken cdna 9130024f11 gene，简称9130024f11rik)位于小鼠的1号染色体，处于satb2反方向上游的位置。9130024f11rik在中枢神经系统的胚胎时期(e11.5,e14和e18)中表达呈上升趋势，在e14.5的全脑和成年的大脑皮层表达水平较高。该基因与satb2基因呈反向转录，且与satb2的5’-非翻译区(5’-utr)部分重叠。
3、lncrna-9130024f11rik在大脑中特异性表达，与satb2基因呈反向转录且与之部分重叠。9130024f11rik的这些结构特征暗示其很有可能
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型及其构建方法、应用，利用crispr/cas9技术构建神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠模型，为神经性疾病的研究以及药物研发及药效评价提供有效的实验动物模型。
2、本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
3、本专利技术提出一种构建神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标rna(guide-rna)，所述特异性靶向rna包括guide-rna 1、guide-rna 2、guide-rna3、guide-rna 4、guide-rna 5、guide-rna 6、guide-rna 7和guide-rna 8，所述guide-rna1的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述guide-rna 2的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述guide-rna 3的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述guide-rna 4的核苷酸序列如seqid no：4所示，所述guide-rna 5的核苷酸序列如seq id no：5所示，所述guide-rna 6的核苷酸序列如seq id no：6所示，所述guide-rna 7的核苷酸序列如seq id no：7所示，所述guide-rna 8的核苷酸序列如seq id no：8所示，其中，所述guide-rna 1和所述guide-rna2作用于9130024f11rik基因的intron 1靶序列，所述guide-rna 3和所述guide-rna 4作用于所述9130024f11rik基因的intron 2靶序列，所述guide-rna 5和所述guide-rna 6作用于9130024f11rik基因的intron 3靶序列，所述guide-rna 7和所述guide-rna 8作用于所述9130024f11rik基因的intron 4靶序列，所述intron 1靶序列如seq id no：9所示，所述intron 2靶序列如seq id no：10所示，所述intron 3靶序列如seq id no：11所示，所述intron 4靶序列如seq id no：12所示。
4、本专利技术提出一种神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
5、s1、根据9130024f11rik基因的结构确定敲除intron 1-4，并针对所述9130024f11rik基因的intron 1-4设计特异性靶向rna；
6、s2、将有活性的所述特异性靶向rna和cas9质粒体外转录成mrna，得到sgrna和cas9mrna，然后通过显微镜注射将所述sgrna、所述cas9 mrna以及含有loxp位点的donordna片段注射到小鼠受精卵中；
7、s3、将所述小鼠受精卵移植到代孕母鼠体内，从后代中筛选得到9130024f11rik阳性杂合子(f/+)；
8、s4、将所述9130024f11rik阳性杂合子(f/+)与野生型c57bl/6j小鼠交配、繁殖，得到杂合子敲除鼠(f/+)，然后将所述杂合子敲除鼠(f/+)雌雄同笼进行自交，经基因型鉴定，得到神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型，即纯合子基因敲除鼠(f/f)。
9、进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，所述基因型鉴定采用短片段pcr方法，所述短片段pcr方法的引物包括9130024f11rik-p1、9130024f11rik-p2和9130024f11rik-p3，所述9130024f11rik-p1的核苷酸序列如seq id no：13所示，所述9130024f11rik-p2的核苷酸序列如seq id no：14所示，所述9130024f11rik-p3的核苷酸序列如seq id no：15所示。
10、进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，所述短片段pcr方法采用的pcr反应体系为：
11、0.5ul9130024f11rik-p1正向引物
12、0.5ul9130024f11rik-p2反向引物
13、0.5ul9130024f11rik-p3反向引物
14、7.5ul2×pcr mix
15、5ulddh2o。
16、进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120v、80a的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
17、进一步地，在本专利技术的较佳实施例中，所述采用电泳的方式对pcr扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为纯合子小鼠(f/f)。当3个引物在同一种体系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标RNA，其特征在于，所述特异性靶向RNA包括guide-RNA 1、guide-RNA 2、guide-RNA 3、guide-RNA4、guide-RNA 5、guide-RNA 6、guide-RNA 7和guide-RNA 8，所述guide-RNA 1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述guide-RNA 2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述guide-RNA 3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述guide-RNA 4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述guide-RNA 5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述guide-RNA 6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述guide-RNA 7的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述guide-RNA 8的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中，所述guide-RNA 1和所述guide-RNA 2作用于9130024F11Rik基因的Intron 1靶序列，所述gui
2.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因型鉴定采用短片段PCR方法，所述短片段PCR方法的引物包括9130024F11Rik-P1、9130024F11Rik-P2和9130024F11Rik-P3，所述9130024F11Rik-P1的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述9130024F11Rik-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述9130024F11Rik-P3的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述短片段PCR方法采用的PCR反应体系为：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定，所述电泳的步骤为：使用1.5％的琼脂糖凝胶，在120V、80A的条件下电泳20min后，使用凝胶成像仪查看结果并保存。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述采用电泳的方式对PCR扩增的产物进行鉴定为：若为一条359bp的条带，为野生型小鼠(+/+)，若为359bp和457bp两条带，为杂合子小鼠(f/+)，若为一条457bp的条带，则为所述神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型。
7.一种神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1～6任意一项所述的构建方法构建得到。
8.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在大脑发育分子机理研究中的应用。
9.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病研究中的应用。
10.如权利要求7所述的神经特异性敲除9130024F11Rik基因突变小鼠动物模型在神经性疾病药物研发及药效评价中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种构建神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型的特异性靶标rna，其特征在于，所述特异性靶向rna包括guide-rna 1、guide-rna 2、guide-rna 3、guide-rna4、guide-rna 5、guide-rna 6、guide-rna 7和guide-rna 8，所述guide-rna 1的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述guide-rna 2的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述guide-rna 3的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述guide-rna 4的核苷酸序列如seq id no：4所示，所述guide-rna 5的核苷酸序列如seq id no：5所示，所述guide-rna 6的核苷酸序列如seq id no：6所示，所述guide-rna 7的核苷酸序列如seq id no：7所示，所述guide-rna 8的核苷酸序列如seq id no：8所示，其中，所述guide-rna 1和所述guide-rna 2作用于9130024f11rik基因的intron 1靶序列，所述guide-rna 3和所述guide-rna 4作用于所述9130024f11rik基因的intron 2靶序列，所述guide-rna 5和所述guide-rna 6作用于9130024f11rik基因的intron 3靶序列，所述guide-rna 7和所述guide-rna 8作用于所述9130024f11rik基因的intron 4靶序列，所述intron 1靶序列如seq id no：9所示，所述intron 2靶序列如seq id no：10所示，所述intron 3靶序列如seq id no：11所示，所述intron 4靶序列如seq id no：12所示。
2.一种神经特异性敲除9130024f11rik基因突变小鼠动物模型的构建方法，...
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