【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体公开了一种基于多基因扩增的海分枝杆菌样本快速鉴定方法。
技术介绍
1、海分枝杆菌是一种常见的非典型分枝杆菌，可引起人体感染，主要以皮肤感染首发症状，表现为单发或者沿着淋巴管分布的红斑、结节、斑块，部分皮损可出现坏死、糜烂及溃疡。皮肤感染后常常迁延不愈或瘢痕形成、严重者可影响患者容貌，累及关节部位可导致功能丧失，在免疫功能低下的患者经皮肤感染后可导致系统性播散，甚至死亡。随着广谱抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂等大量应用，器官移植开展和人口老龄化，免疫受损和低下人群逐渐增多，由非海分枝杆菌皮肤感染的发病率逐年增高。由于交通运输高速发展，海分枝杆菌感染的患者不再局限分布沿海地区，内陆地区患者的发病率也出现逐渐增高的趋势。因皮肤及其他部位的感染缺乏特异性的临床表现、临床易于误诊误治，因此亟需快速精准的诊断方法。海分枝杆菌在沿海及内陆多种水产及相关产品中均可以分离到该菌，这导致存在较高的潜在致病风险。因此对此类产品海分枝杆菌的污染或感染，亦亟需相关的诊断手段。
2、现阶段，海分枝杆菌分离鉴定方法包括培养法、高通量测序法、免疫学方法等，但都存在耗时长，费用高，阳性率低等局限性，缺乏一种快速有效的方法对各种可疑携带海分枝杆菌的样本进行鉴定。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种基于多基因扩增的海分枝杆菌样本快速鉴定方法，从纯化的菌落到含有海分枝杆菌的组织的一整套完整的dna提取及海分枝杆菌特异性引物的组合的扩增方案，具有特异性及阳性率高，时间短，成本低等优点。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种基于多基因扩增的海分枝杆菌样本快速鉴定方法，包括以下步骤：
4、(1)选取ncbi数据库中细菌及海分枝杆菌基因组的基因进行初步筛选，确定细菌通用的16s基因、rpob基因、热休克蛋白家族基因设计特异性引物，并分别命名为引物1、引物2、引物3和引物4；
5、(2)普通pcr引物灵敏度验证；
6、(3)荧光定量pcr引物特异性验证；
7、(4)建立小鼠皮肤海分枝杆菌感染模型，待病灶形成后取感染部位新鲜组织，称取100mg感染组织，由dna提取试剂盒提取新鲜组织dna，取10ngdna样本1、样本2、样本3和样本4对引物扩增；
8、(5)取新鲜感染组织的dna样本进行dna扩增，分别进行1.5％琼脂糖电泳检测及荧光pcr图像采集；
9、(6)采用石蜡包埋组织对dna提取；
10、(7)对石蜡包埋感染组织普通pcr检测。
11、进一步的，所述步骤(2)中，普通pcr引物灵敏度验证方法：提取海分枝杆菌标准菌株的dna样本，测定其浓度后，从200ngdna样本开始稀释，梯度分别为200、100、50、25、12.5、5、1，分别用引物1、引物2、引物3和引物4进行pcr扩增；
12、扩增后的产物采用1.5％琼脂糖凝胶电泳。
13、进一步的，所述步骤(2)中，所述荧光定量pcr引物特异性验证的方法为提取海分枝杆菌标准菌株及临床分离菌株进行荧光定量pcr检测，并采用染料法进行扩增。
14、进一步的，所述步骤(6)中，石蜡包埋组织dna提取的方法：
15、a、取感染组织的石蜡包埋样本，切片，切片厚度10μm每片，每10片为一管，置于1.5ml离心管中；
16、b、加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s，12000rpm室温离心2min，弃上清，加入1ml无水乙醇，涡旋10s，12000rpm室温离心2min，弃上清，室温放置10min，充分挥发乙醇；
17、c、加入200μlga缓冲液及20μl蛋白酶酶，56℃孵育1h，置于90℃1h，加入220μlgb缓冲液，涡旋混匀，加入250μl无水乙醇，涡旋混匀。
18、d、将上述混合液转移到核酸吸附柱，8000rpm离心2min，蛋白洗脱液洗脱柱子上的蛋白，8000rpm离心1min，弃滤液；
19、e、取50μl65℃的ddh2o，垂直加入吸附柱，室温静置3min，12000rpm离心2min，收集滤液，并检测dna浓度。
20、进一步的，石蜡包埋感染组织普通pcr检测方法：
21、取石蜡包埋感染组织的dna进行dna扩增，分别进行1.5％琼脂糖电泳检测及荧光pcr图像采集。
22、与现有的方法相比，本专利技术建立了一种从纯化的菌落到含有海分枝杆菌的组织的一整套完整的dna提取及海分枝杆菌特异性引物的组合的扩增方案，可以采用普通pcr或荧光pcr，相较于传统的培养法明显缩短检测时长，相较于组学的方法显著减少成本支出，操作简单易行，具有特异性及阳性率高，时间短，成本低等优点。
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1.一种基于多基因扩增的海分枝杆菌样本快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(2)中，普通PCR引物灵敏度验证方法：提取海分枝杆菌标准菌株的DNA样本，测定其浓度后，从200ngDNA样本开始稀释，梯度分别为200、100、50、25、12.5、5、1，分别用引物1、引物2、引物3和引物4进行PCR扩增；
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(2)中，所述荧光定量PCR引物特异性验证的方法为提取海分枝杆菌标准菌株及临床分离菌株进行荧光定量PCR检测，并采用染料法进行扩增。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(6)中，石蜡包埋组织DNA提取的方法：
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(7)中，石蜡包埋感染组织普通PCR检测方法：
【技术特征摘要】
1.一种基于多基因扩增的海分枝杆菌样本快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述步骤(2)中，普通pcr引物灵敏度验证方法：提取海分枝杆菌标准菌株的dna样本，测定其浓度后，从200ngdna样本开始稀释，梯度分别为200、100、50、25、12.5、5、1，分别用引物1、引物2、引物3和引物4进行pcr扩增；
3.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：史冬梅，冯亚辉，李亚男，
申请(专利权)人：济宁市第一人民医院济宁市医学科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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