【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，尤其是涉及农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法。
技术介绍
1、小花灯心草(juncus articulatus linn.2n＝80)是灯心草科(juncaceae)灯心草属(juncus)的多年生草本植物，是一种湿生植物，在我国多地地区均有分布。灯心草属(juncus)在我国共有属植物77种，10变种以及1亚种，可用于园林绿化，还可作为药用植物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和催眠镇静等多种药理作用，具有较好的药品开发前景。
2、小花灯心草根系发达，具有很强的抗污能力，能够在富营养化和重金属污染水体中正常生长，可以大量吸收水中过剩的氮、磷和钾等营养盐用于自身生长，还能有效地吸附富集铜、铅和镉等重金属，具有较好的净化效果。因此，将小花灯心草作为湿地生态修复的潜力物种，具有一定的应用前景。目前，国内外对灯心草属植物的研究较少，且主要集中在药用价值考证、重金属积累的生理特性和单面叶发育形态结构等方面。小花灯心草遗传转化体系的研究尚未见报道，极大的限制了其在功能基因的调控机理和种质资源创制等领域的研究。为了进一步促进小花灯心草的种质资源开发利用，深入探究单面叶发育的基因作用机制，本研究建立了高效稳定的小花灯心草遗传转化体系，为后期加快育种进程和基因功能研究奠定了坚实的理论基础。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法，确定了最优的遗传转化体系，平均转化效率可达6.53％，为后期加快育种进程和基因功能研
2、为实现上述目的，本专利技术提供了农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法，包括以下步骤：
3、s1、转化受体确定，选取小花灯心草的成熟种子为外植体，以成熟胚诱导的结构紧实且呈黄色颗粒状的愈伤组织为转化受体；
4、s2、农杆菌介导转化，将愈伤组织放置在空培养皿中，用农杆菌菌液进行浸染处理，然后共培养；
5、s3、然后将步骤s2中愈伤组织转移到含有草铵膦的诱导培养基和再生培养基中培养筛选；
6、s4、继续培养并筛选得到抗性再生植株。进一步的，所述步骤s2的具体操作为：在农杆菌菌液中添加100μmol/l乙酰丁香酮，农杆菌菌液浸染愈伤组织30min，浸染过程中超声波处理5min，真空处理20min，然后吸除菌液，用滤纸将愈伤组织表面吸干转入铺有灭菌滤纸的诱导培养基上在28℃黑暗条件下共培养3天。
7、进一步的，所述农杆菌菌液的浓度为od600值＝0.6。
8、进一步的，所述步骤s3的具体操作为：将愈伤组织转移到含有1.0mg/l草铵膦的诱导培养基中，在黑暗培养箱中培养4-8w，然后转入含有1.2mg/l草铵膦的再生培养基中继续筛选8-12w，并转入光照培养箱中培养。
9、进一步的，所述黑暗培养箱的条件为28℃，24h黑暗，光照培养箱的条件为28℃，16h光照，8h黑暗。
10、进一步的，所述步骤s4的具体操作为：每3-4周继代一次，4-5个月后抗性愈伤组织在含1.2mg/l草铵膦的再生培养基上产生绿色抗性再生幼苗，待抗性再生幼苗在培养瓶中生长有健壮的根系后，转至温室中单株种植。
11、本专利技术所述的农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法的优点和积极效果是：
12、1、本专利技术以小花灯心草的成熟种子为外植体，确定了筛选剂草铵膦在小花灯心草的愈伤组织诱导和再生阶段的最佳筛选压；比较分析了乙酰丁香酮添加浓度、共培养、菌液浓度及超声波处理时间、真空处理时间对转化效率的影响，最高和平均gus基因瞬时转化效率可达89.01％和62.16％。
13、2、本专利技术中经gus组织染色、pcr和southern blot检测，bar基因片段成功转入小花灯心草基因组中，获得了转基因阳性植株，首次建立并优化了小花灯心草的农杆菌介导的遗传转化体系，平均转化效率可达6.53％，为后期加快育种进程和基因功能研究奠定了坚实的理论基础。
14、下面通过附图和实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
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1.农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤S2的具体操作为：在农杆菌菌液中添加100μmol/L乙酰丁香酮，农杆菌菌液浸染愈伤组织30min，浸染过程中超声波处理5min，真空处理20min，然后吸除菌液，用滤纸将愈伤组织表面吸干转入铺有灭菌滤纸的诱导培养基上在28℃黑暗条件下共培养3天。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于：所述农杆菌菌液的浓度为OD600值＝0.6。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤S3的具体操作为：将愈伤组织转移到含有1.0mg/L草铵膦的诱导培养基中，在黑暗培养箱中培养4-8w，然后转入含有1.2mg/L草铵膦的再生培养基中继续筛选8-12w，并转入光照培养箱中培养。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：所述黑暗培养箱的条件为28℃，24h黑暗，光照培养箱的条件为28℃，16h光照，8h黑暗。
6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤S4的具体操作为：每
...【技术特征摘要】
1.农杆菌介导的小花灯心草遗传转化体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤s2的具体操作为：在农杆菌菌液中添加100μmol/l乙酰丁香酮，农杆菌菌液浸染愈伤组织30min，浸染过程中超声波处理5min，真空处理20min，然后吸除菌液，用滤纸将愈伤组织表面吸干转入铺有灭菌滤纸的诱导培养基上在28℃黑暗条件下共培养3天。
3.根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于：所述农杆菌菌液的浓度为od600值＝0.6。
4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述步骤s3的具体操作为...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪莉，王增裕，孙娟，杨国锋，姜佳，姜凯，王玉竹，孙琪，胡晓辰，武轩阳，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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