【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，具体涉及一种rt-raa-crispr冻干体系及其试剂盒、检测体系与应用形式。
技术介绍
1、随着诊断技术的发展，分子诊断技术逐渐成为人类日常生活中诊断疾病的重要检测手段，随着检测靶标的多样化，多重检测的应用越来越广泛。
2、重组酶介导的链置换(raa)扩增反应发展到今天已有10多年的时间，随着科学技术不断的发展和进步，恒温raa技术已经成为分子生物学中重要的技术之一，并广泛用于卫生防疫、遗传学、微生物学等。目前恒温扩增体系灵敏度难以得到突破，调整引物量提升体系灵敏度的同时，常常会造成特异性的问题。
3、现有技术常常通过寻找新的引物或者探针的方法来提升体系的灵敏性，同时不影响其特异性，但这种方法局限性较大，适用性较低，对于不同的扩增反应可能需要寻找不同的引物或者探针，并没有从根本上解决问题。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种raa-crispr冻干体系及其应用形式，通过将rt-raa扩增体系以及buffer冻成球后，再使用核酸复溶，可以实现在体系浓度不变的情况下模板上样量最大化，有效提升反应灵敏性且选择与-crispr检测体系联用，提升了试剂的检测特异性。
2、具体的，本专利技术提供了一种rt-raa-crispr冻干体系，包括：
3、恒温扩增冻干体系，所述恒温扩增冻干体系包括rt-raa冻干预混液、引物f、单链结合蛋白、引物r、探针p、depc水；
4、buffer冻干体
5、crispr冻干体系，所述crispr冻干体系包括crispr冻干保护剂、buffer 3.1、cas12a、rna酶抑制剂、crrna、ssdna、depc水。
6、在一些优选实施方式中，所述恒温扩增冻干体系组分浓度为：
7、rt-raa冻干预混液40μl、引物f(10μm)2.4μl、单链结合蛋白30～60μg、引物r(10μm)2.4μl、depc水补足50μl。
8、在一些优选实施方式中，所述单链结合蛋白添加量为除原预混液的含量外，另外添加40μg。
9、在一些优选实施方式中，所述crispr冻干体系各组分添加量为：
10、crispr冻干保护剂14.7μl、1x buffer 3.1、10pmol/μl cas 12a 0.175μl、40u/μlrna酶抑制剂0.175μl、1μm crrna 3.5μl、25μm ssdna 1.75μl、depc水补足35μl。
11、在一些优选实施方式中，所述引物f核苷酸序列为seq id no：1，所述引物r核苷酸序列为seq id no：2。
12、在一些优选实施方式中，所述crrna核苷酸序列为seq id no：3，所述ssdna核苷酸序列为seq id no：4。
13、根据本专利技术的另一方面，本专利技术进一步提供了一种乙型流感crispr核酸检测试剂盒，包括：
14、如上任一所述的raa-crispr冻干体系。
15、在一些优选实施方式中，乙型流感crispr核酸检测试剂盒还包括buffer微球。
16、根据本专利技术的另一方面，本专利技术进一步提供了一种rt-raa-crispr检测体系，包括：
17、恒温扩增检测体系，所述恒温扩增检测体系包括含乙型流感扩增引物的rt-raa冻干微球、buffer微球、样本核酸、醋酸镁；
18、crispr检测体系，所述crispr检测体系包括含crrna以及ssdna的crispr冻干微球、如上所述的bufferbuffer微球、扩增产物、depc水。
19、根据本专利技术的另一方面，本专利技术进一步提供了一种rt-raa-crispr检测体系，包括：
20、恒温扩增检测体系，所述恒温扩增检测体系包括含乙型乙型流感扩增引物的rt-raa冻干微球、如上所述的bufferbuffer微球、样本核酸；
21、crispr检测体系，所述crispr检测体系包括含crrna以及ssdna的crispr冻干微球、扩增产物、depc水。
22、在一些优选实施方式中，rt-raa产物扩增产物添加量：crispr检测总体积为1：14～3:7。
23、本专利技术本专利技术基于rt-raa(重组酶介导的链置换)技术与crispr技术，建立了一种rt-raa-crispr双球体系，通过将rt-raa扩增体系以及反应中比不可少的buffer冻成球后，再使用核酸复溶，可以在体系浓度不变的情况下模板上样量最大化，有效提升反应灵敏度，同时保留了检测体系的特异性。
24、与现有技术相比，本专利技术至少具有以下一项有益效果：
25、1、本专利技术建立了一种rt-raa-crispr双球冻干体系，保证了模板上样量最大化，提高灵敏度的同时，不影响检测的特异性。
26、2、buffer以微球的形式装载，无需在扩增完成后再进行检测时重新配制试剂，可以短时间内快速筛查病毒，提高了检测效率，简化了实验流程。
27、3、本专利技术可以与上海伯杰bg-nova-x8以一体的形式搭载，直接上样检测。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，所述恒温扩增冻干体系组分包括：
3.根据权利要求2所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，所述单链结合蛋白添加量为除原预混液的含量外，另外添加40μg。
4.根据权利要求1所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，所述CRISPR冻干体系各组分添加量为：
5.根据权利要求1所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，所述引物F核苷酸序列为SEQ ID NO：1,所述引物R核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
6.根据权利要求1所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系，其特征在于，所述CrRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：3，所述ssDNA核苷酸序列为SEQ ID NO：4。
7.乙型流感CRISPR核酸检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任一所述的RT-RAA-CRISPR冻干体系。
8.根据权利要求7所述的乙型流感CR
9.RT-RAA-CRISPR检测体系，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的RT-RAA-CRISPR检测体系，其特征在于，RT-RAA产物扩增产物添加量：CRISPR检测总体积为1：14～3:7。
...【技术特征摘要】
1.rt-raa-crispr冻干体系，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的rt-raa-crispr冻干体系，其特征在于，所述恒温扩增冻干体系组分包括：
3.根据权利要求2所述的rt-raa-crispr冻干体系，其特征在于，所述单链结合蛋白添加量为除原预混液的含量外，另外添加40μg。
4.根据权利要求1所述的rt-raa-crispr冻干体系，其特征在于，所述crispr冻干体系各组分添加量为：
5.根据权利要求1所述的rt-raa-crispr冻干体系，其特征在于，所述引物f核苷酸序列为seq id no：1,所述引物r核苷酸序列为seq id no：2。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：李沛，赵冰，张雪纯，赵百慧，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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