用于核酸扩增的微球制剂、扩增方法及在联合检测中的应用技术

本发明专利技术涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及用于核酸扩增的微球制剂、扩增方法及在联合检测中的应用。本发明专利技术提供的用于核酸扩增的微球制剂能够在2～8℃下长期保存，并且，本发明专利技术提供的微球制剂在使用时，不额外添加溶剂，而是直接与待测样本混合，在不改变原有体系浓度的前提下，能够显著提高体系中模板含量，从而提高检测的灵敏度。将本发明专利技术提供的核酸扩增用的微球制剂用于RPA、RAA，或者在RPA或RAA基础上，联合第二反应构成的双重或者多重检测中，能够显著高提高灵敏度，同时保证扩增的特异性。同时保证扩增的特异性。同时保证扩增的特异性。

【技术实现步骤摘要】
150～151.19mg，ATP 0.15μmol，dNTP各0.01μmol，Tris
‑
Ac 0.5μmol。
[0013]优选地，所述微球制剂包括逆转录酶657.89～663.13μg。
[0014]在可选实施方式中，所述重组酶选自T4 UvsX蛋白、T6 UvsX蛋白或Rb69 UvsX蛋白。
[0015]优选地，所述辅助蛋白选T4 UvsY蛋白、T6 UvsY蛋白或Rb69 UvsY蛋白。
[0016]优选地，所述DNA聚合酶为链置换DNA聚合酶，选自金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段或T4噬菌体Klewnowexo
‑
聚合酶。
[0017]优选地，所述逆转录酶包括M
‑
MLV逆转录酶。
[0018]优选地，所述单链结合蛋白选自T4 GP32蛋白、T6 GP32蛋白或Rb69 GP32蛋白。
[0019]在可选实施方式中，所述微球制剂还包括第二微球，所述第二微球含有复溶剂PEG和/或镁盐激活剂。
[0020]优选地，每克第二微球中含有PEG 960～980mg和/或镁盐265.0～265.5μmol。
[0021]第二方面，本专利技术提供了前述实施方式任一项所述的微球制剂在RPA或RAA中的应用。
[0022]第三方面，本专利技术提供了微球制剂的制备方法，所述微球制剂包括前述实施方式任一项所述微球制剂；
[0023]所述制备方法包括，将微球制剂各组分混合均匀后，以不少于25s的时间间隔滴注于液氮中，微球在液氮中保存时间不低于1h后，转移至冻干机中进行冻干，按照冻干程序进行冻干干燥得到微球制剂；
[0024]所述冻干程序为梯度升温冻干干燥方法，依次包括预冻步骤、主干燥步骤和终末干燥步骤。
[0025]优选地，所述预冻步骤的温度为
‑
54℃以下，处理时长为0.5～1h。
[0026]优选地，所述主干燥步骤的温度为
‑
27～
‑
15℃，处理时长为2～6h，真空度为0.01～30Pa；进一步优选地，所述主干燥步骤包括至少两个梯度升温处理过程。
[0027]优选地，所述终末干燥步骤的温度为0～20℃，处理时长为2h以上，真空度为0.01～1Pa；进一步优选地，所述终末干燥步骤包括至少四个梯度升温处理过程。
[0028]第四方面，本专利技术提供了采用前述实施方式任一项所述微球制剂进行核酸扩增的方法，所述方法包括，按照每克反应微球对应0.263～6.58mL待扩增样本溶液的添加比例，向扩增样本溶液中加入反应微球，而后按照如下(a)～(c)任一项进行扩增：
[0029](a)加入液体复溶剂与激活剂，混匀后，于37～44℃条件下直接扩增20min；
[0030](b)加入第二微球后，于37～44℃条件下扩增20min，所述第二微球含有复溶剂PEG和镁盐激活剂；
[0031](c)复溶后加入第二微球，于37～44℃条件下扩增20min，所述第二微球含有镁盐激活剂。
[0032]第五方面，本专利技术提供了微球制剂在核酸扩增联合第二反应方法中的应用，所述微球制剂包括前述实施方式任一项所述微球制剂；
[0033]所述核酸扩增采用前述实施方式所述的核酸扩增方法；
[0034]所述第二反应使用的制剂均为微球制剂；
[0035]所述第二反应包括荧光反应或CRISPR反应。
[0036]优选地，所述荧光反应包括在RPA或RAA体系冻干前体系中加入EXO酶以及探针，即可实时检测RPA或RAA荧光反应。
[0037]优选地，所述EXO酶选自外切酶为核酸外切酶III。
[0038]优选地，所述CRISPR反应包括Cas12 CRISPR检测体系以及Cas13CRISPR检测体系。
[0039]在可选实施方式中，所述第二反应方法包括，向扩增产物中直接加入用于第二反应的微球制剂，完成第二反应。
[0040]在可选实施方式中，所述第二反应为CRISPR反应，所述CRISPR反应使用的微球制剂的制备方法为：配置CRISPR冻干体系，而后采用前述实施方式所述方法制备CRISPR反应使用的微球制剂；
[0041]所述CRISPR冻干体系含有：CRISPR冻干保护剂10uL/test，Buffer 1
×
，Cas12蛋白40～100nmol/L，Cas13蛋白40～100nmol/L，mRNA酶抑制剂5U，T7 RNA polymerase 14U，rNTP 0.5～0.6mM，CrRNA1 0.1μM，ssDNA 0.8～1.2nmol/L，ssRNA 0.8～1.2nmol/L。
[0042]优选地，所述Cas12蛋白选自LbCas12a，FnCas12a，AsCas12a(cpf1)，BbCas12a(cpf1)，HkCas12a(cpf1)。
[0043]优选地，所述Cas13蛋白包括LwaCas13a。
[0044]优选地，所述T7 RNA polymerase来源于大肠杆菌表达。
[0045]第六方面，本专利技术还提供了前述实施方式任一项所述微球制剂在扩增自显色反应中的应用，每克微球制剂中还包括EXO酶0.4613～12.13mg。
[0046]优选地，每克微球制剂中包括EXO酶0.6579～0.6667mg。
[0047]本专利技术提供的用于核酸扩增的微球制剂能够在2～8℃下长期保存，并且，本专利技术提供的微球制剂在使用时，不额外添加溶剂，而是直接与待测样本混合，能够显著提高模板浓度上限，从而提高多重检测中的灵敏度。
[0048]将本专利技术提供的核酸扩增用的微球制剂用于RPA、RAA，或者在RPA或RAA基础上，联合第二反应构成的双重或者多重检测中，能够显著高提高灵敏度，同时保证扩增的特异性。
附图说明
[0049]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0050]图1为本专利技术提供的只供RPA或RAA反应的微球制剂的包装形式；
[0051]图2为本专利技术提供的包括复溶微球或激活微球的微球制剂的包装形式；
[0052]图3为本专利技术提供的用于RPA
‑
CRISPR反应的微球制剂的包装形式；
[0053]图4为本专利技术提供的不同种类的微球制剂的独立包装形式。
具体实施方式
[0054]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是
本专利技术一部分实施例，而不是全部的实本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于核酸扩增的微球制剂，其特征在于，所述微球制剂包括由扩增反应所需的混合试剂经冻干得到的反应微球，每克反应微球中含有：DNA聚合酶131.58～530.5μg，单链结合蛋白2.632～13.263mg，重组酶0.9867～3.316mg，辅助蛋白0.395～1.33mg，每种引物0.0075～0.02nmol，肌酸激酶657.89～663.13μg，ATP 0.1～0.2μmol，DTT 0.0026～0.015mmol，磷酸激酶0.1～0.5mmol，dNTP各0.008～0.012μmol,Tris
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Ac 0.5～2.5μmol，麦芽糖0～663.13mg，PEG 131.58～663.13mg。2.根据权利要求1所述的微球制剂，其特征在于，所述微球制剂用于RNA扩增体系，每克微球制剂中还包括逆转录酶394.74～795.76μg。3.根据权利要求1或2所述的微球制剂，其特征在于，所述微球制剂包括由扩增反应所需的混合试剂经冻干得到的反应微球，每克反应微球中含有：DNA聚合酶460.53～464.19μg，每种引物0.013nmol，单链结合蛋白10.53～10.61mg，重组酶1.71～1.72mg，辅助蛋白1.05～1.06mg，麦芽糖394.74～397.88mg，PEG 150～151.19mg，ATP 0.15μmol，dNTP各0.01μmol，Tris
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Ac 0.5μmol；优选地，所述微球制剂包括逆转录酶657.89～663.13μg。4.根据权利要求3所述的微球制剂，其特征在于，所述重组酶选自T4 UvsX蛋白、T6 UvsX蛋白或Rb69 UvsX蛋白；优选地，所述辅助蛋白选T4 UvsY蛋白、T6 UvsY蛋白或Rb69 UvsY蛋白；优选地，所述DNA聚合酶为链置换DNA聚合酶，选自金黄色葡萄球菌的DNA聚合酶I的大片段、枯草芽孢杆菌DNA聚合酶I大片段、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段或T4噬菌体Klewnowexo
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聚合酶；优选地，所述逆转录酶包括M
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MLV逆转录酶；优选地，所述单链结合蛋白选自T4 GP32蛋白、T6 GP32蛋白或Rb69 GP32蛋白。5.根据权利要求4任一项所述的微球制剂，其特征在于，所述微球制剂还包括第二微球，所述第二微球含有复溶剂PEG和/或镁盐激活剂；优选地，每克第二微球中含有PEG 960～980mg和/或镁盐265.0～265.5μmol。6.权利要求1～5任一项所述的微球制剂在RPA或RAA中的应用。7.微球制剂的制备方法，其特征在于，所述微球制剂包括权利要求1～5任一项所述微球制剂；所述制备方法包括，将微球制剂各组分混合均匀后，以不少于25s的时间间隔滴注于液氮中，微球在液氮中保存时间不低于1h后，转移至冻干机中进行冻干，按照冻干程序进行冻干干燥得到微球制剂；所述冻干程序为梯度升温冻干干燥方法，依次包括预冻步骤、主干燥步骤和终末干燥步骤；优选地，所述预冻步骤的温度为
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54℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：李沛，赵百慧，李春燕，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：