【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测，具体地，涉及一种检测大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)和传染性脾肾坏死病毒(isknv)的双重检测技术。
技术介绍
1、大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass virus,lmbv)属于虹彩病毒科蛙病毒属，大口黑鲈虹彩病毒易感染加州鲈，且致死率高，给加州鲈养殖业造成了严重的经济危害。同时大口黑鲈虹彩病毒感染后的临床症状在不同地区存在差异，通常没有特征性的临床症状，难以通过临床症状进行诊断。
2、传染性脾肾坏死病毒(infection spleenand kidney necrosis virus,isknv)是虹彩病毒科肿大细胞病毒属的代表种，可感染鳜鱼、加州鲈、笋壳鱼、乌鳢等多种鱼类，引起鱼类脾脏、肾脏肿大及坏死，腮发白、呈缺血状的淡红色，肝脏苍白等症状。
3、随着生活环境的复杂性，单一病原体感染不再是水产养殖中死亡的主要原因，而合并感染发生的频率更高，lmbv和isknv由于其高发病率和高死亡率，严重威胁着水产养殖的健康发展，目前分子生物学检测中应用较多的方法是聚合酶链式反应(pcr)、实时荧光定量pcr、lamp技术，虽然关于目前lmb v和isknv已有研究基础，但尚无研究报道lmbv和isknv混合病原检测技术的研究。
技术实现思路
1、本专利技术提供大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组及其在制备试剂盒中的应用，以解决现有技术中不能快速、方便同时检测水产养殖中大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)和传染性脾肾坏死
2、大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组，包括：
3、大口黑鲈虹彩病毒引物组和传染性脾肾坏死病毒引物组；
4、所述大口黑鲈虹彩病毒引物组由核苷酸序列如seq id no.1所示的正向引物f、核苷酸序列如seq id no.2所示的反向引物r和核苷酸序列如seq id no.3所示的荧光探针q组成；
5、所述传染性脾肾坏死病毒引物组由核苷酸序列如seq id no.4所示的正向引物f、核苷酸序列如seq id no.5所示的反向引物r和核苷酸序列如seq id no.6所示荧光探针q组成；
6、所述荧光探针q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
7、进一步地，所述核苷酸序列如seq id no.3所示的荧光探针q的5’端标记荧光基团6-fam，3’端标记淬灭基团bhq1；
8、所述核苷酸序列如seq id no.6所示荧光探针q的5’端标记荧光基团6-vic，3’端标记淬灭基团mgb。
9、本专利技术还提供所述双重检测引物组在制备检测试剂或试剂盒中的应用。
10、更优地，所述试剂盒中还包含2×qpcr预混液、密封液、阳性对照和阴性对照。
11、更优地，所述阳性对照为含有大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)检测靶标基因和传染性脾肾坏死病毒(isknv)的检测靶标基因的质粒dna，所述大口黑鲈虹彩病毒检测靶标基因的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述传染性脾肾坏死病毒检测靶标基因的核苷酸序列如seqid no.8所示，所述阴性对照为无rna酶的去离子水。
12、本专利技术还提供一种含有所述双重检测引物组的反应体系，所述的大口黑鲈虹彩病毒引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.3～0.4μm、0.3～0.4μm和0.1～0.2μm；所述的传染性脾肾坏死病毒引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.3～0.4μm、0.3～0.4μm和0.06～0.1μm；2×qpcr预混液12.4～12.6μl，待检样品3～5μl，加无rna酶的去离子水至25μl。
13、进一步地，所述的大口黑鲈虹彩病毒引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.32μm、0.32μm和0.16μm；所述的传染性脾肾坏死病毒引物组中，正向引物f、反向引物r和荧光探针q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.32μm、0.32μm和0.08μm；2×qpcr预混液12.5μl，待检样品5μl，加无rna酶的去离子水至25μl。
14、进一步地，所述反应体系的反应条件为55℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s，45个循环。
15、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
16、本专利技术的大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)检测引物组和传染性脾肾坏死病毒(isknv)检测引物组，能分别特异性扩增大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)和传染性脾肾坏死病毒(isknv)，并且能在同一qpcr体系中同时进行扩增，实现了多重qpcr检测，可直接从复杂样品中同时检测大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒，简化了检测实验操作步骤，缩短了整体的检测时间，提升了检测效率。特异性强，对lmbv的检测限为1copy/μl，对isknv的检测限为10copies/μl。还具有实验重复性好和操作便捷快速的优点，不需要昂贵仪器即可完成检测，可用于大口黑鲈虹彩病毒(lmbv)和传染性脾肾坏死病毒(isknv)的现场快速、准确检测。有助于早期和准确地检测这两种病原体，有望成为监测水产养殖健康发展的有力工具。
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1.大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组，其特征在于，
3.如权利要求1或2所述双重检测引物组在制备检测试剂或试剂盒中的应用。
4.如权利要求1或2所述双重检测引物组在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×qPCR预混液、密封液、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阳性对照为含有大口黑鲈虹彩病毒检测靶标基因和传染性脾肾坏死病毒检测靶标基因的质粒DNA，所述大口黑鲈虹彩病毒检测靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述传染性脾肾坏死病毒检测靶标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述阴性对照为无RNA酶的去离子水。
6.一种含有权利要求1或2所述双重检测引物组的反应体系，其特征在于，所述的大口黑鲈虹彩病毒引物组中，正向引物F、反向引物R和荧光探针Q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.3～0.4μM、0.3～0.4μM和0.1～0.2μM
7.根据权利要求6所述反应体系，其特征在于：所述的大口黑鲈虹彩病毒引物组中，正向引物F、反向引物R和荧光探针Q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.32μM、0.32μM和0.16μM；所述的传染性脾肾坏死病毒引物组中，正向引物F、反向引物R和荧光探针Q引物在所述反应体系中的终浓度分别为0.32μM、0.32μM和0.08μM；2×qPCR预混液12.5μL，待检样品5μL，加无RNA酶的去离子水至25μL。
...【技术特征摘要】
1.大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的大口黑鲈虹彩病毒和传染性脾肾坏死病毒的双重检测引物组，其特征在于，
3.如权利要求1或2所述双重检测引物组在制备检测试剂或试剂盒中的应用。
4.如权利要求1或2所述双重检测引物组在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×qpcr预混液、密封液、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述阳性对照为含有大口黑鲈虹彩病毒检测靶标基因和传染性脾肾坏死病毒检测靶标基因的质粒dna，所述大口黑鲈虹彩病毒检测靶标基因的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述传染性脾肾坏死病毒检测靶标基因的核苷酸序列如seq id no.8所示，所述阴性对照为无rna酶的去离子水。
6.一种含有权利要求1或2所述双重检测引物组的反应体系，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹炜伟，张璜，朱华，但学明，田驰，
申请(专利权)人：广东科贸职业学院，
类型：发明
国别省市：
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