【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程，尤其涉及一种蒙古冰草的遗传转化方法。
技术介绍
1、蒙古冰草(agropyron mongolicum)属于禾本科(poaceae)小麦族(triticeae)冰草属(agropyron)植物，具有抗寒、抗旱、耐盐、耐风沙等特性，营养价值和生态价值较高，是改良天然草场及建立人工草地的适宜草种。
2、目前，由于缺少蒙古冰草遗传转化体系，有关蒙古冰草的研究主要集中在外植体的再生诱导、将基因克隆出来后在其他植物中进行异源表达等方面，在分子育种方面的研究比较滞后，因此，如何建立蒙古冰草高效且稳定的遗传转化体系显得尤为重要。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术旨在提供一种蒙古冰草的遗传转化方法，包括如下步骤：
2、步骤一、对蒙古冰草的外植体进行诱导形成愈伤组织，将所述愈伤组织进行继代和分化培养，获得转化受体；
3、步骤二、对步骤一获得的转化受体用农杆菌侵染液进行一次侵染；
4、步骤三、对步骤二侵染后的转化受体进行暗培养筛选，筛选后采用农杆菌侵染液进行二次侵染；
5、步骤四、对完成侵染的转化受体进行共培养，确定侵染效果。
6、其中，本申请在针对蒙古冰草设计建立遗传转化方法时发现，即便是侵染效果较好的基因型，其仍存在侵染能力退化非常快的问题，在进行目的基因转化时侵染效率大大降低。而本申请采用进行暗培养一段时候后再进行二次侵染的方法，使其在重复侵染后侵染效率得到了显著提升，并且目的基因能
7、在一个实施方式中，所述步骤一中，愈伤组织的诱导培养在诱导培养基中进行，所述诱导培养基包括：ms基础培养基，5mg·l-1 2,4-d，30g·l-1蔗糖，7.8g·l-1琼脂，ph5.8；诱导培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
8、在一个实施方式中，所述步骤一中，愈伤组织的继代培养在继代培养基中进行，所述继代培养基包括：ms基础培养基，5mg·l-1 2,4-d，30g·l-1蔗糖，7.8g·l-1琼脂；继代培养的条件为：温度25℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗。
9、在一个实施方式中，所述步骤一中，蒙古冰草的外植体选自种子、根、茎、叶、花中的一种或多种，优选种子。
10、在一个实施方式中，所述步骤二中一次侵染，和/或所述步骤三中二次侵染方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～0.5mpa条件下抽真空5～20min，20khz～30khz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～0.5mpa条件下抽真空5～20min。
11、在优选的实施方式中，一次侵染和/或二次侵染的参数条件为：于0.1mpa条件下抽真空10min，20khz下超声振荡5min，再于0.1mpa条件下抽真空10min。
12、在优选的实施方式中，一次侵染和二次侵染采用完全相同的步骤参数。
13、在一个实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌。
14、在一个实施方式中，所述农杆菌中含有能够表达目的基因的重组载体。
15、可选的，所述目的基因为筛选标记基因，例如荧光标记基因。
16、在一个实施方式中，所述农杆菌侵染液的od600值为0.2～0.5，优选为0.3。
17、在一个实施方式中，所述步骤三中暗培养的条件为：将一次侵染后的转化受体置于筛选培养基上，于22℃～26℃、黑暗环境下培养20～70天，且每2周继代一次。
18、优选的，暗培养条件为：于25℃、黑暗环境下培养30～60天。
19、在一个实施方式中，所述筛选培养基为含有30g·l-1蔗糖、7.8g·l-1琼脂、2mg·l-1 2,4-d、300mg·l-1特美汀、30mg·l-1潮霉素的ms培养基。
20、在一个实施方式中，所述步骤四中共培养的方法包括：取出转化受体并除去过多的农杆菌，于22℃～26℃，黑暗条件下培养3～4天。
21、在一个实施方式中，可将转化受体从菌液中捞出后置于滤纸上吹干以除去过多的附着菌，并在滤纸上进行共培养。
22、在一个实施方式中，共培养的条件为：于25℃，黑暗条件下培养4天。
23、在一个实施方式中，所述方法还包括对侵染成功的转化受体进行分化筛选培养和生根培养的步骤。
24、在一个实施方式中，所述分化筛选培养在分化筛选培养基中进行，所述分化筛选培养基包括：ms基础培养基，30g·l-1蔗糖，7.8g·l-1琼脂，0.5mg·l-16-ba，2mg·l-1kt，300mg·l-1特美汀，2mg·l-1潮霉素。培养条件为：光照强度2000lx，光周期为8小时光照，16小时黑暗，15-25天继代一次；经过4-6周筛选培养之后，未转化材料死亡，转化材料能够继续生长；2-3月后，阳性愈伤组织进行分化。
25、在一个实施方式中，所述生根培养在生根培养基中进行，所述生根培养基包括：1/2ms基本培养基，15g·l-1蔗糖，7.8g·l-1琼脂，300mg·l-1特美汀。培养条件为：待分化苗在培养皿中长至4-6cm时继代在生根培养基上，在27℃下，光周期为8小时光照/16小时黑暗，培养10-20天生根。
26、另一方面，本申请提供了所述的方法在制备提高侵染效率和/或提高目的基因表达稳定性的蒙古冰草中的应用。
27、在一个实施方式中，所述目的基因包括gus基因。
28、与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：
29、本申请以蒙古冰草的种子为外植体，对其诱导生成的愈伤组织进行遗传转化实验，设计并成功建立了蒙古冰草的遗传转化体系，为蒙古冰草的分子育种研发提供了新方法。进一步，本申请提供的方法采用在一次侵染后暗培养筛选一段时间后再进行二次侵染的方式，将易侵染基因型蒙古冰草的侵染效率由不足5％提高到80％以上，并且在暗培养筛选2个月后，转入的目的基因仍能稳定的在蒙古冰草愈伤组织中表达，有效改善了蒙古冰草愈伤组织的侵染能力退化以及目的基因转入易失败进而难以稳定表达的问题。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种蒙古冰草的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，蒙古冰草的外植体选自种子、根、茎、叶、花中的一种或多种，优选种子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中一次侵染，和/或所述步骤三中二次侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min，20kHz～30kHz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～0.5MPa条件下抽真空5～20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中暗培养的条件为：将一次侵染后的转化受体置于筛选培养基上，于22℃～26℃、黑暗环境下培养20～70天，且每2周继代一次。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述筛选培养基为含有30g·L-1蔗糖、7.8g·L-1琼脂、2mg·L-1 2,4-D、300mg·L-1特美汀、30mg·L-1潮霉素的MS培养基。
...【技术特征摘要】
1.一种蒙古冰草的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，蒙古冰草的外植体选自种子、根、茎、叶、花中的一种或多种，优选种子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中一次侵染，和/或所述步骤三中二次侵染的方法包括：将转化受体置于农杆菌侵染液中，于0.05～0.5mpa条件下抽真空5～20min，20khz～30khz条件下超声振荡3～10min，再于0.05～0.5mpa条件下抽真空5～20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌为根癌农杆菌或发根农杆菌；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中暗培养的条件为：将一次侵染后的转化受体置于筛选培养基上，于22℃～26℃、黑...
【专利技术属性】
技术研发人员：付春祥，赵彦，赵海霞，姜希萍，吴振映，李宇琛，杜锦瑜，邱锐，曹英萍，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：
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